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        果蝇胚

        相关实验:核纤层和富含核纤层组分的制备实验

        最新修订时间:

        材料与仪器

        实验材料
        试剂、试剂盒
        仪器、耗材

        步骤

        胚收集和制备

        1. 可用任一种方法收集果蝇胚(Oregon R P2 或任何其他的野生系)。

        制备匀浆

        2. 直接在 9 倍体积的抽提缓冲液(溶液 E ) 中融化冻存胚。

        溶液 E:

        250 mmol/L 蔗糖

        50 mmol/L NaCl

        50 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.5),( 25℃)

        5 mmol/L MgCl2

        1 mmol/L PMSF

        1 mmol/L TPCK

        2.5 mmol/L NEM

        3. 胚完全融化后在带紧密结合研杵(A ) 的 Dounce 匀浆器中推捣 4 次使之破碎,用 4 层溶液 E 浸透的 120 μm 尼龙网过滤匀浆。

        细胞核组分粗品的纯化

        4. 过滤后,2000 g 离心匀浆 10 分钟。

        5. 吸出上清,沉淀部分(含细胞核)重悬浮于 0.5 倍体积的溶液 E 中。

        6. 再加 4.5 倍体积的溶液 E 稀释细胞核悬液,按上述方法(2000 g 10 分钟)离心。

        7. 重复一次步骤 5 和 6(重悬浮、稀释、离心)。

        细胞核的热稳定/核酸酶消化处理

        8. 将最后一次 2000 g 离心后的细胞核用带宽松结合研杵(B ) 的 Dounce 匀浆器重悬浮于 0.5 倍体积的 20 mmol/L Tris-HCl  (pH 7.5),5 mmol/L MgCl2 溶液中。

        9. 再加 0.5 倍体积的上述溶液,然后加入终浓度分别为 8 μg/ml 和 10 μg/ml 的 RNA 酶 A 和 DNA 酶Ⅰ。

        10. 将重悬浮后加核酸酶的细胞核在 37℃ 孵育 5 分钟。

        用非离子活化剂和 NaCI 抽提热稳定的、核酸酶处理过的细胞核

        11. 2000 g 离心 10 分钟回收热稳定和核酸酶消化的细胞核。

        12. 向沉淀中(含热稳定的核酸酶处理的细胞核)加入 0.9 倍体积的溶液 F,用带宽松结合研杵(B ) 的匀浆器重悬浮。

        溶液 F:

        292 mmol/L 蔗糖

        10 mmol/L Tris-HCl (pH 7.5)

        0.1 mmol/L MgCl2

        13. 加 0.1 倍体积的 20% (w/v) Triton X-100 到细胞核悬液中,使 Tnton X-100 的终浓度为 2% (w/V),冰上孵育 10 分钟。

        14. 将经过热稳定,核酸酶处理,非离子活化剂抽提的细胞核在 2000 g 离心 10 分钟。

        15. 用带宽松结合研件(B ) 的 Dounce 匀浆器将含有热稳定的,核酸酶处理和非离子活化剂抽提过的细胞核的沉淀组份重悬浮于 0.45 倍体积的溶液 F 中。

        16. 加 0.05 倍体积的 1 mol/L Tris-HCl (pH 7.5),然后加 0.5 倍体积的 2 mol/L NaCl,使 NaCl 终浓度为 1 mol/L,将悬液在冰上孵育 10 分钟。

        17. 10000 g 离心 10 分钟回收不溶复合物,重悬浮沉淀,像 15 和 16 步中那样再次用 NaCI 抽提。

        18. 10000 g 离心 10 分钟将核基质-核膜孔复合物-核纤层组份收集于沉淀组分中,用溶液 F 重悬浮。

        来源:丁香实验

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