细胞的制备和异核体的构建

细胞的共培养

1. 融合前 12~24 小时，将小鼠细胞铺到无菌的玻璃盖玻片使其能在上面充分附着和伸展。

2. 融合前 3 到 4 小时，用胰酶消化下人细胞，铺到载有小鼠细胞的玻璃盖玻片上，人细胞的数量应等于或略高于鼠细胞的数量，这也是为了使异种融合效果更好。

3. 再将共培养物在 37℃ 孵育 2~3 小时，以使人细胞能附着到盖玻片上而又不会过分伸展。此时可加入放线菌酮（CHX；50~100 μg/ml）以阻止新蛋白合成。

异核体形成

4. 用预热的不含 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 的 PBS 温和地冲洗两次带有共培养物的盖玻片。

5. 用小镊子夹起盖玻片，控干多余的 PBS，带细胞的一面朝下放到一滴预热的 50% PEG 的 PBS 溶液上。

6. 将盖玻片在 PEG 中准确地孵育 2 分钟。

7. 拿起盖玻片，注意不要使其滑动（会损伤细胞），用 PBS 彻底冲洗两次。可以用一黄吸头顶住盖玻片的一端同时用小镊子从另一端抬起盖玻片，这样可以避免盖玻片滑动。

8. 将盖玻片放回到培养液中（如果需要，仍然要含蛋白质合成抑制剂），孵育足够长时间活跃穿梭的蛋白质会在融合后的 2 到 4 个小时后在异核体中的细胞核之间达到平衡。

9. 在孵育结束时固定并通透化细胞。