从组织中分离线粒体

1. 取出肝脏，注意不要弄破胆囊。放进一置于冰上的烧杯中，剪去任何结缔组织。称其质量后放回烧杯中。用锋利的剪刀、手术刀或剃须刀片将之切成 1~2 mmol/L 的薄片，用匀浆缓冲液（1x MS) 冲洗两次以去除大部分的血。转移至匀浆器中。加入足够的匀浆缓冲液，制备 1:10 的匀浆。

1 x MS（匀浆缓冲液）

210 mmol/L 甘露醇

70 mmol/L 蔗糖

5 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5

1 mmol/L EDTA，pH 7.5

2. 在一较冷的房间里，使研杵以 500 r/min 的速度转动进行匀浆，直到仅留下结缔组织。通常需要 2~6 次研磨。

3. 将匀浆转至离心管中，用少量缓冲液清洗匀浆器内壁并加至离心管中（如果后面要进行标志酶检测，还要留下一些匀浆），1300 g 离心 10 分钟以沉淀末破碎的细胞。细胞核、细胞质膜和结缔组织纤维。

4. 将上清移至干净试管中，置冰上保存。

5. 用起始体积一半的匀浆缓冲液重悬浮沉淀，1300 g 离心 10 分钟。

6. 取出上清片加到第 4 步的上清中。

7. 两次的上清一起 1300 g 离心 10 分钟。收集上清，再次离心。

8. 收集上清，17000 g 离心 15 分钟以沉淀线粒体。

9. 弃去上清，用 Kimwipe 清除离心管内壁粘连的脂肪和碎片。

10. 用缓冲液悬浮并在 17000 g 离心 15 分钟，漂洗线粒体两遍。

11. 将最终的沉淀用一定体积的适于后续工作的缓冲液悬浮。