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        从组织培养细胞中分离线粒体

        相关实验:线粒体分离实验

        最新修订时间:

        材料与仪器

        实验材料
        试剂、试剂盒
        仪器、耗材

        步骤

        1. 用 11 ml 冰上预冷过的 RSB 重新悬浮细胞,转移到一个 15 ml 的 Dounce 匀浆器中

        RSB(使组织培养细胞膨胀的低渗缓冲液)

        10 mmol/L NaCl

        2.5 mol/L MgCl2

        10 mmol/L Tris-HCl,pH 7.5

        2. 让细胞膨胀 5~10 分钟。用相差显微镜监测膨胀过程。

        3. 用研杵 B ( 小间隙型)研磨几下使膨胀细胞破碎。

        4. 立刻加入 8 ml 2.5x MS 缓冲液至终浓度为 1x MS。用封口膜封住匀浆器顶端,倒转数次使溶液混匀(如果要进行标志酶检测,还要留下部分匀浆 )。

        2.5 x MS 缓冲液:

        525 mmol/L 甘露醇

        175 mmol/L 蔗糖

        12.5 mmol/L Tris-HCl,pH 7.5

        2.5 mmol/L EDTA,pH 7.5

        1 x MS 缓冲液:

        210 mmol/L 甘露醇

        70 mmol/L 蔗糖

        5 mmol/L Tris-HCl,pH 7.5

        1 mmol/L EDTA,pH 7.5

        5. 将匀浆转至离心管中进行差速离心。用少量 MS 清洗匀浆器并将清洗液加入匀浆中,用 MS 缓冲液将体积加至 30 ml。

        6. 匀浆在 1300 g 离心 5 分钟以去除细胞核、未破碎的细胞和大的膜碎片。

        7. 将上清倒在一个干净的离心管中。

        8. 重复“沉淀细胞核”步骤两次。

        9. 将上清移至一干净离心管中,17000 g 离心 15 分钟沉淀线粒体。

        10. 弃去上清,用 Kimwipe 吸干离心管内表面。

        11. 1X MS 重悬浮沉淀以漂洗线粒体,重复 17000 g 离心步骤。

        12. 弃上上清,用适合后续工作的缓冲液重悬浮沉淀。

        来源:丁香实验

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