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        从植物组织中分离高尔基体

        相关实验:高尔基体的分离实验

        最新修订时间:

        材料与仪器

        实验材料
        试剂、试剂盒
        仪器、耗材

        步骤

        1. 先用剪刀大致剪切叶片或茎杆,然后在少量的介质中用刀片切成碎片。

        2. 对于 1 g 新鲜组织,在 1 ml 介质中用研钵和杵捣碎使组织匀浆化。

        匀浆介质:

        50 mmol/L FiEPES

        10 mmol/L KCI

        1 mmol/L EDTA

        10 mmol/L 抗坏血酸

        0.1% BSA

        5 mmol/L DTT,pH 7.5

        0.4 蔗糖

        3. 用单层的 Miracloth 挤压浓缩的匀浆液以除去没有破碎的细胞、细胞壁和细胞碎片。

        4. 将匀浆液转移至 35 ml 或 50 ml 的离心管中。

        5. 用吊桶式转头以 1000 g 离心 10 分钟来除去细胞核、淀粉和完整的叶绿体。

        6. 将 1000 g (10分钟)的离心上清铺到不连续的蔗糖梯度上,梯度是在 35 ml 的管中用含有 4 ml 的 37% (w/v) 的蔗糖和 8 ml 21.5% 的蔗糖制备的。

        从植物组织中分离高尔基体


        7. 以 22000 r/min 离心 30 分钟(65000 g,Spinco SW28 转头)。

        8. 将位于匀浆液与 21.5% 蔗糖界面处的膜(为内质网)以及位于 22.5%-37% 蔗糖界面处的膜(为高尔基体)收集于不同的管中,悬于梯度上层的黄色清亮上清中 。

        9. 以 20000 r/min ( 50000 g,SW28 转头)离心 20 分钟或以相似的条件(17000 r/min 30分钟,35000 g,SS-34 Sorval 转头)离心使重悬后的物质沉淀出来。

        10. 为除去污染的质体和质膜,将沉淀重悬于含有 5 mmol/L 磷酸钾(pH 6.8 ) 的 0.5 ml 的 0.25 mol/L 蔗糖中,然后加到含有 5.9% PEG 4000 和 5.9% (w/w) 葡聚糖 T-500 ( Phamiada) 的 4-g 两相系统中。

        11. 在冰浴达到平衡之后,每一只两相管用石蜡封口膜盖住并用拇指按下;将管子在低温下作 40 次剧烈翻转之后重新在冰浴中平衡。

        12. 用低速离心(750 r/min,100~200 g,10分钟)分相。

        13. 分别收集上相(含界面)和下相,用不含蔗糖和膜的匀浆介质稀释。

        14. 以 20000 r/min ( 50000 g)离心 20 分钟收集。

        来源:丁香实验

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