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        蛋白丝/苏氨酸磷酸酶,1型和2A型(PP-1和PP-2A)

        相关实验:磷酸酶制备实验

        最新修订时间:

        材料与仪器

        实验材料
        试剂、试剂盒

        步骤

        一、组织/细胞制备和提取

        1. 配制下列溶液:

        (1) 缓冲盐清洗液:

        20 mmol/L 的 MOPS 缓冲液,pH 7.5(配成 100 ml)

        5 mmol/L 的 EDTA

        5 mmol/L 的 EGTA

        120 mmol/L 的 NaCl

        (2) 抽提缓冲液

        20 mmol/L 的 MOPS,pH 7.5(配成 10 ml)

        5 mmol/L EDTA

        5 mmol/L EGTA

        60 mmol/L 的 β-巯基乙醇 (1:250 原液)

        10% 甘油加

        新鲜加入的 1 mmol/L PMSF,PMSF 在异丙醇中制成 100 mmol/L 的储存液。

        2. 准备细胞或组织

        (1) 对于培养细胞

        ① 除去绝大部分的培养基,直接把培养容器(培养皿或培养瓶)放在冰上以冷却组织培养细胞。

        ② 用 5 ml 冰冷的缓冲盐洗涤液冲洗培养容器两次,倒掉洗液,加入 1 ml 洗液用橡皮细胞刮把细胞收集到 1 ml 清洗液中。

        ③ 在一个微型离心机中以 2000 g,离心悬液 2 分钟,收集细胞,倒掉上清。

        ④ 在 1 ml 的冰冷抽提缓冲液中悬浮沉淀的细胞,然后,在中等强度下超声处理 30 秒。在微型离心机中以 13000 g,将超声物高速离心 5 分钟。

        (2) 对于组织样本

        ① 把切取的动物组织放到塑料袋中,完全浸泡于冰水中彻底冷却样本 5 分钟。

        ② 用剪刀把组织(1~2 g ) 切成碎片,每克组织混悬于 1 ml 的组织抽提缓冲液中。

        ③ 用一个 Polytron (Biinkmaim) 或者 Teflon-玻璃匀浆器匀均组织,并且以 13000 g 离心 10 分钟。

        3. 保存上清液或细胞浆(第 2 步)作为分离 PP-1 和 PP-2A 的启始材料。用去污剂抽取颗粒部分以分离 PTPase。

        二、用连续层析分离 PP-1 和 PP-2A

        细胞浆通过 DEAE-Sepharose 以结合 PP-1 和 PP-2A,然后用氨基己基(AH) Sepharose 把 PP-2A 与 PP-1 分离。下面的步骤适合于 0.25 ml 的 DEAE 小珠。

        1. 准备层析缓冲液

        层析缓冲液:

        20 mmoI/L 的 MOPS,pH 7.5 ( 制备 500 ml )

        1 mmol/L 的 MgCl2

        60 mmol/L 的 β-巯基乙醇

        10% 甘油

        2. 用层析缓冲液平衡 DEAE-Seplwose(Phamacia)至 pH 7.5,用洗脱缓冲液(0.5 mol/L 的氯化钠)平衡 AH-Sepharose (Pharmacia)。

        3. 在一个有扣盖或螺旋盖的密封小管中将每毫升上清液与 0.25 ml 平衡好的 DEAE-Sepharose 混合,在冰箱中翻转样品液 30 分钟。

        4. 准备一个两腔的装置,上层滤膜用来滞留珠状介质,但允许缓冲液在离心过程中穿过,进入底部接收器。

        5. —分钟离心沉淀 DEAE,然后用吸管吸出上清弃去。

        6. 用 0.5 ml 的层析缓冲液清洗 DEAE 小珠 3 次,用低速离心(2000 r/min) 使液体与小珠分离。

        7. 用 0.5 ml 的洗脱缓冲液(0.5 mol/L 的氯化钠)从 DEAE中洗脱磷酸酶,在溶液中悬浮小球,然后在新试管中收集洗脱物。

        8. 为了从 PP-2A 中分离 PP-1,把来自于 EDAE 的洗脱液直接与 0.25 ml 的 AH-Sepharose(Phamiacia) 混合,翻转混合 15 分钟。

        9. 过滤 AH-Sephrose,从非结合部分回收 PP-1;PP-2 仍结合在 Sepharose 中。

        10. 用 1.0 ml 的洗脱缓冲液(0.5 mol/L 的氯化钠)洗涤 AH-Scpharose,用 0.5 ml 洗脱缓冲液(1.5 mol/L 的氯化钠)从 AH-Sepharose 中洗脱 PP-2A。

        11. 在 100 ml 量筒中透析含有 PP-2A 的混合洗脱液,透析液用 50 ml 的层析缓冲液(用 2-巯基乙醇制成 150 mmol/L),加 50 ml 的甘油(保持冰冷浆状),用窄的透析袋(SpectraPor,7.6mm,12000 分子量截留,可从 Fisher、VWR 等供应商处获得),用封口膜封紧量筒,用手慢慢上下转动 15 分钟,然后放许冷处至少 2 小时。

        来源:丁香实验

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