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        代谢标记

        相关实验:蛋白质磷酸化的测定实验

        最新修订时间:

        材料与仪器

        实验材料
        仪器、耗材

        步骤

        1. 用 60 mm 或 100 mm 培养瓶,在完全培养基中培养细胞至所希望的密度。

        2. 用预热的低磷酸培养基(无放射性磷酸盐)冲洗两次,然后加入含 0.5~1 mCi32P/ml 的低磷酸培养基(50~100 μmol/L 无机磷酸)。

        3. 培养结束后,回收 32P 标记培养基,用 10 ml Aquasol (NewEnglandNuclear) 或 Ecolume(ICNBiomedicak) 稀释,取一等份用液闪计数器测定 32P 活性。测定培养基中磷酸浓度 (Sanui 1974)(可以用无 32P 的低磷酸培养基)。从这两个数据计算标记培养基 中 32P 比活 。

        4. 无二价离子的 PBS 清洗 32P 标记的细胞两次。每个 100 mm 培养皿加 1 ml 预热的裂解缓冲液在沸水浴中裂解细胞。用一次性细胞刮刷将细胞裂解物刮到一边,然后吸到 1.5 ml 离心管,热水浴 10 分钟。

        5. 冷却至室温。由于 DNA 的舒展,裂解物变得很黏稠。

        6. 留上清,加 NP40 至 2%,加 MgCl2 至 5 mmol/L ( 都用母液)。加无蛋白酶的 DNA 酶Ⅰ与 RNA 酶各 0.1 mg,室温放置 20 分钟。

        来源:丁香实验

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