原代MEF的分离和冻存

1. 准备下列试剂和材料：

确定怀孕期的母鼠（孕期14至6天）

无菌解剖器械（镊子、剪刀、手术刀片）

Cellector 带收集装置的不锈钢滤网，1 mm 直径筛网

内有搅拌棒的 125 ml 无菌的胰蛋白酶消化的烧瓶

有搅拌盘的培养箱

无 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 的 PBS

胰蛋白酶溶液

DNase 溶液（10 mg/ml）

MEF 生长培养基

MEF 冻存培养基

150 mm 和 100 mm 组织培养皿

2 ml 冷冻管

2. 杀死怀孕 14~16 天的母鼠，取出子宫，放在盛有 PBS 的 100 mm 组织培养皿中，取出胚胎，去胚胎外组织，PBS 冲洗去血。

3. 用无菌镊子去胚胎头和内脏。

4. 胚胎转移到盛有 40 ml PBS 的 50 ml 无菌离心管中，轻轻颠倒两次。小心倒掉 PBS，再加 40 ml PBS 清洗。倒掉 PBS，留 10 ml 将胚胎转移到 100 mm 培养皿。

5. 手术刀片细细切碎胚胎，用镊子挤压使其通过无菌滤网。15 ml 胰酶溶液冲洗滤网两次，解剖胚胎混合物转移至 125 ml 胰酶消化的烧瓶。加 400 μl DNase 粗品，以免释放出的 DNA 导致溶液过黏。

6. 湿润的 5% CO₂ 温箱中 37℃ 轻轻搅动孵育 30 分钟。

7. 由烧瓶侧臂把上层细胞悬液倒入一装有 10 ml MEF 生长培养基的 50 ml 离心管。

8. 离心收集细胞。

9. 30 ml MEF 生长培养基洗两次。

10. 细胞悬于 15 ml 生长培养基，用血细胞计数可存活有核细胞（非血红细胞或碎片）。10 只 15 天幼鼠可获得 5X10⁷ 到 1X10⁸ 细胞。

11. 6X10⁶ 细胞悬于 25 ml MEF 生长培养基，接种一块 150 mm 培养皿（总计接种 10~15 块）。

12. 24 小时后更换新鲜 MEF 生长培养基。

13. 约 2~4 天后细胞长满，1:5 传代。分 8 批操作，15 ml PBS 冲洗，倒掉，加 10 ml 胰酶溶液，37℃ 孵育 5 分钟。

14. 每块胰酶消化的细胞板加 10 ml 生长培养基，轻柔吹吸，分散细胞，转移到 50 ml 离心管，两块板的细胞合并到一管中。

15. 离心收集细胞。细胞悬于培养基中，1:5 分加到 150 mm 培养皿。

16. 约 3 天后细胞长满，可以收获冻存于液氮中。分 8 批操作，15 ml PBS 冲洗，倒掉，加 10 ml 胰酶，37℃ 孵育 5 分钟。

17. 加 10 ml MEF 生长培养基，轻柔吹吸，分散细胞，转移到 50 ml 离心管。

18. 离心收集细胞。每块培养皿收获的细胞悬于 2 ml 冻存培养基。

19. 每支冷冻管加 1 ml 细胞，旋紧盖子，-80℃ 冰箱过夜。此步操作需迅速。

20. 第二天将细胞转移至液氮中。转移过程中需放在干冰上避免升温。