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        用碱性磷酸酶进行DNA片段的去磷酸化

        相关实验:用碱性磷酸酶进行 DNA 片段的去磷酸化

        最新修订时间:

        材料与仪器

        步骤

        一、材料

        1. 缓冲液和溶液

        氯仿

        EDTA ( 0.5 mol/L,pH 8.0) 或 EGTA ( 0.5 mol/L,pH 8.0) (如使用 CIP)

        乙醇

        酚:氯仿(1:1,V/V)

        SDS (10% m/V)( 如使用 CIP)

        醋酸钠(3 mol/L,pH 7.0 [ 如使用 CIP] 和 pH 5.2)

        TE ( pH 7.6)

        Tris-Cl(1 mol/L,pH 8.5)

        2. 酶和缓冲液

        牛小肠碱性磷酸酶(CIP) 或虾碱性磷酸酶(SAP) (US Biochemical 公司, Boehringer Mannheim 公司或 Worthington Biochemicals 公司)

        10X CIP 去磷酸化缓冲液或 10X SAP 去磷酸化缓冲液

        蛋白酶 K

        限制性内切核酸酶

        3. 核酸和寡核苷酸

        DNA 样品(0.1~10 μg [ 1-100 pmol])

        4. 专用设备

        预先设定至 56℃、65℃ 或 75℃ (CIP) 或 70℃ (SAP) 水浴或加热板

        用碱性磷酸酶进行DNA片段的去磷酸化

        二、方法

        1. 用所选择的限制性内切核酸酶完全消化 1~10 μg (10~100 pmol) DNA 使去磷酸化。

        2. 用 CIP 或 SAP 使已经限制酶切的 DNA 5' 端去磷酸化。

        (1) 用 CIP 进行 DNA 的去磷酸化

        ① 向 DNA 中加入:

        10X CIP 去磷酸化缓冲液  5 μl

        水                                 加至 48 μl

        ② 加入适量的 CIP。

        ③ 37℃ 温育反应 30 min 后,加入第二等份 CIP,继续温育 30 min。

        ④ 在温育反应结束后,加入 SDS 和 EDTA(pH 8.0) 至终浓度分别为 0.5% 和 5 mmoI/L 以灭活 CIP,充分混匀备试剂,再加入蛋白酶 K 至终浓度为 100 μg/ml,56℃ 下温育 30 min。

        ⑤ 将反应冷却至室温,先用酚: 氯仿抽提 2 次,再以氯仿单独抽提 1 次以纯化 DNA。

        (2) 用 SAP 进行 DNA 去磷酸化

        ① 向 DNA 中加入:

        10X SAP 去磷酸化缓冲液     5 μl

        水                                      加至 48 μl

        ② 加入适量的 SAP。

        ③ 37℃ 温育反应 1 h。

        ④ 为灭活 SAP,将反应转移至 70℃ 加热 20 分钟,然后冷却至室温。

        3. 将水相转移至一个清洁的微量离心管中,如用 SAP,则在 0.1 体积的 3 mol/L 醋酸钠(pH 5.2) 的存在下用标准乙醇沉淀回收 DNA;如使用 CIP,则用 0.1 体积的 3 mol/L 醋酸钠(pH 为 7.0)。

        4. 室温下干燥沉淀物,然后溶于 TE (pH 7.6),使 DNA 的浓度 > 2 nmol/ml。

        用碱性磷酸酶进行DNA片段的去磷酸化

        来源:丁香实验

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