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        用大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段标记双链DNA的3’端

        相关实验:用大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段标记双链DNA的3’端

        最新修订时间:

        材料与仪器

        步骤

        一、材料

        1. 缓冲液和溶液

        乙酸铵(10 mol/L )

        乙醇

        2. 酶和缓冲液

        适宜的限制性内切核酸酶

        大肠杆菌 DNA 聚合酶 I Klenow 片段

        3. 核酸和寡核苷酸

        含适当未标记的 dNTP 各 1 mmol/L 的 dNTP 溶液

        模板 DNA ( 0.1~5 μg )

        4. 放射性复合物

        [α-32P] dNTP ( 10 mCi/ml,比活性为 800~3000 Ci/mmol)

        5. 专用设备

        Sephadex G-50 离心柱,用 TE ( pH 7.6) 平衡

        预先设定至 75℃ 的水浴

        二、方法

        1. 在 25~50 μl 的适当的限制酶缓冲液内,用所需限制酶消化高达 5 μg 模板 DNA。

        2. 向完成的限制酶消化反应中,加入:

        10 mCi/ml [α-32P] dNTP        
        (比活性 800~3000 Ci/mmol)     2~50 μCi
        未标记的 dNTP                           至终浓度为 100 μmol/L
        Klenow 片段                               1~5 单位

        室温温育反应 15 min。

        3. 于 75℃ 加热 10 min 以终止反应。

        4. 用 Sephadex G-50 离心柱层析分离放射性标记的 DNA 与未掺入的 dNTP 或在 2.5 mol/L 乙酸铵存在下进行两轮乙醇沉淀。

        用大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段标记双链DNA的3’端
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        来源:丁香实验

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