琼脂糖凝胶栓中DNA的限制性内切核酸酶消化

从哺乳动物细胞、酵母或细菌分离的染色体 DNA 在琼脂糖栓中可用所需的内切酶消化。低熔点琼脂糖栓的孔足以使内切酶进入，与作为底物的基因组 DNA 相作用。消化后，经 PFGE 分离，然后回收或做 Southern 印迹分析。

一、材料

1. 缓冲液和溶液

1X 限制酶缓冲液

TE ( pH 7.6)

2. 酶和缓冲液

限制酶

3. 凝胶

脉冲场电泳用的凝胶

4. 核酸和寡核苷酸

包埋在低熔点琼脂糖栓中的基因组 DNA

5. 专用设备

设定在酶切最佳温度的水浴

二、方法

1. 如果凝胶栓未在 TE 中存放（如通过邮寄收到的凝胶栓或一直存放在 0.5 mol/L EDTA 中的），则在 50 倍体积 TE ( pH 7.6) 室温温育 30 min。转移凝胶栓至新的 50 倍体积 TE ( pH 7.6) 室温温育第二个 30 min。否则直接进行步骤 2。

2. 将凝胶栓移入微离心管，每管加入 10 倍体积相应的 1X 限制酶缓冲液。室温温育 30 min。

3. 除去缓冲液，用 2~3 倍体积新鲜 1X 限制酶缓冲液替代它。每管加入 20~30 单位相应限制酶该酶作用的最佳温度温育；如果是 YAC DNA 温育 3 h, 哺乳动物 DNA 温育 5~6 h。

4. 如果 DNA 只用一种酶消化，消化后将凝胶栓浸入 4℃ 20 倍体积的 TE ( pH 7.6) 内。1 h 后按步骤 7 处理。如果 DNA 用一种以上的酶消化，则跳过 TE 温育而进行步骤 5。

5. 如果 DNA 用一种以上的酶消化，加入第二种酶之前再次用相应缓冲液平衡凝胶栓。为了充分平衡，使用自动移液器从每管尽可能多的除去第一个酶的缓冲液，并用 1 ml TE 替代它。除去 TE, 加入新鲜的 1 ml TE。室温存放 30~60 min。轻轻除去 TE。

6. 每管加 10 倍体积第二个 1x 限制酶缓冲液，室温温育 30 min。如步骤 3 描述的进行限制酶消化。最后，每个凝胶栓浸入 4℃ 20 倍体积的 TE (pH 7.6) 内 1 h。

7. 用一次性移液器吸头将凝胶栓直接轻轻推入脉冲场凝胶的加样孔（槽）中，电泳分离 DNA 片段。