酵母DNA的小量制备

通过消化细胞壁，然后用 SDS 裂解随之产生的原生质体就可以制备酵母 DNA。用这种方法可重复性地制备若干毫克的酵母 DNA。得到的酵母 DNA 可被限制性内切核酸酶切割，也可用作 PCR 的模板。

一、材料

1. 缓冲液和溶液

异丙醇

醋酸钾（5 mol/L )

SDS (10%, m/V)

醋酸钠（3 mol/L，pH 7.0)

山梨糖醇缓冲液

TE ( pH 7.4)

含 20 μg/ml RNase 的 TE ( pH 8.0 )

酵母重悬浮缓冲液

2. 酶及其缓冲液

酶解酶 100T

3. 培养基

YFD 培养基

4. 离心机及其转头

Sorvall SS-34 转头或同类产品

5. 专用设备

预置至 65℃ 的水浴

6. 载体及酵母细胞株

酵母细胞

二、方法

细胞培养及其 DNA 的抽提

1. 用 10 ml YPD 培养基培养酵母。将酵母培养物在 30℃、中度振荡条件下培养过夜。

2. 取 5 ml 培养细胞置于离心管中。2000 g ( Sorvall SS-34 转头，4100 r/min）离心 5 min, 收集细胞。将剩下培养物置于 4℃ 储存。

3. 用 0.5 ml 山梨糖醇缓冲液重新悬浮细胞。将细胞悬液转移到一只微量离心管中。

4. 加入 20 μl 酶解酶 100T 的溶液（用山梨糖醇缓冲液配成 2.5 mg/ml 浓度)。将细胞悬液在 37℃ 下温育 1 h。

5. 用微量离心机离心 1 min, 收集细胞，吸弃上清液。

6. 用 0.5 ml 酵母重悬缓冲液重新悬浮细胞。

7. 加入 50 μl 10% 的 SDS。盖上管盖，将离心管快速地翻转数次，混匀后将离心管在 65℃ 下温育 30 min。

8. 加入 0.2 ml 5 mol/L 的醋酸钾溶液，冰浴 1 h。

DNA 的分离

9. 在微量离心机中以最大转速 4℃ 离心 5 min, 使细胞碎片沉积下来。

10. 室温下用粗孔吸头吸取离心上清，转移到一个新的微量离心管中。

11. 加入等体积室温下的异丙醇，沉淀核酸。将管内容物混匀，室温下放置 5 min。

12. 在微量离心机中以最大转速离心 10 s 回收核酸沉淀。吸去离心上清液，将沉淀在空气中干燥 10 min。

13. 用 300 μl 含 20 μg/ml 胰 RNase 的 TE ( pH 8.0 ) 溶解沉淀。将消化混合物在 37℃ 温育 30 min。

14. 加入 30 μl 3 mol/L 的醋酸钠（pH 7.0）。混匀后，加入 0.2 ml 的异丙醇。再次进行混匀。在微量离心机中以最大转速离心 20 s, 使 DNA 沉淀。

15. 吸去上清液，沉淀在空气中干燥 10 min, 用 150 μl TE ( pH 7.0）溶解 DNA。