• 我要登录|
  • 免费注册
    |
  • 我的丁香通
    • 企业机构:
    • 成为企业机构
    • 个人用户:
    • 个人中心
  • 移动端
    移动端
丁香通 logo丁香实验_LOGO
搜实验

    大家都在搜

      大家都在搜

        0 人通过求购买到了急需的产品
        免费发布求购
        发布求购
        点赞
        收藏
        wx-share
        分享

        大量培养物中分离 BAC DNA

        相关实验:大量培养物中分离 BAC DNA

        最新修订时间:

        原理

        BAC 重组子的精细分析,包括详细的限制酶切图谱、DNA 测序或亚克隆,所需 DNA 量都超过小量制备所能提供的量。本方案的制备流程适用于重组 BAC 的大规模培养物。500 ml BAC 转化菌的平均产量为 20~25 μg BAC DNA。还可用柱层析对 DNA 产物进一步纯化。

        材料与仪器

        步骤

        一、材料

        1. 缓冲液和溶液

        乙醇

        异丙醇

        酚: 氯仿(1:1, V/V)

        DNA 提取液

        碱性裂解液Ⅰ,预冷

        碱性裂解液Ⅱ

        碱性裂解液Ⅲ,预冷

        STE 溶液,预冷

        TE ( pH 8.0)

        2. 酶和缓冲液

        溶菌酶

        限制性内切核酸酶

        3. 核苷酸与寡核苷酸

        脉冲场凝胶电泳的 DNA 标准参照物

        4. 凝胶

        脉冲场凝胶电泳仪

        5. 培养基

        含 12.5 μg/ml 氯霉素的 LB 培养基

        6. 离心机与转头

        Sorvall GSA 转头或同类产品,备有 Oakridge 管(Nalgene)

        7. 专用设备

        层析树脂

        8. 载体和菌株

        BAC 转化的大肠杆菌

        二、方法

        1. 将 50 μl 过夜培养的饱和 BAC 转化菌接种到 500 ml 含 12.5 μg/ml 氯霉素的 LB 培养基中,37℃ 剧烈振荡(300 r/min) 培养 12~16 h 至细胞达到饱和。

        2. 4℃ 下,2500 g(Sorvall GSA 转头 3900 r/min)离心 15 min,收集细胞,弃上清,倒置离心瓶使最后一滴上清流尽。

        3. 用 100 ml 冰预冷的 STE 重新悬浮细菌沉淀。按步骤 2 方法离心收集细菌。

        4. 用 24 ml 含无 DNase 的 RNA 酶(100 μg/ml ) 的碱性裂解液Ⅰ溶解细菌。加溶菌酶至终浓度为 1 mg/ml。

        5. 加入 24 ml 新鲜配制的碱性裂解液Ⅱ。盖紧离心瓶盖,轻轻翻转瓶子数次,使内容物完全混匀,冰浴 5 min。

        6. 加入 24 ml 冰预冷的碱性裂解液Ⅲ,盖紧离心瓶盖,轻轻涡旋离心瓶使内容物完全混匀,至无明显的两相分层现象,置冰上 5 min。

        7. 4℃ 下,15000 g(Sorvall GSA 转头 9600 r/min)离心细菌裂解液 10 min,然后将上清转移至另一聚丙烯离心瓶中。弃去离心瓶中的沉淀。

        8. 加等体积的酚:氯仿。轻轻翻转离心瓶数次,混匀水相和有机相。室温下 3000 g ( Sorvall GSA 转头 4300 r/min ) 离心 15 min,使两相分离。

        9. 用一宽口径吸头将水相移至一新离心瓶中,加入等体积的异丙醇,翻转离心瓶数次,混匀。

        10. 在离心瓶的一侧做标记,并且将有标记的一侧放在远离转头中心的一面。此标记有助于接下来确定核酸沉淀的位置。室温下 15000 g ( Sorvall GSA 转头 9600 r/min) 离心 15 min, 回收核酸沉淀。

        11. 小心弃去上清,将离心瓶倒立在一纸中上,至最后一滴上清流尽。室温下用 20 ml 70% 乙醇漂洗沉淀和管壁。吸干乙醇,室温下将瓶倒立在一叠纸巾上几分钟,使乙醇挥发殆尽。

        12. 小心地将 BAC DNA 沉淀溶于 0.2 ml TE ( pH 8.0) 中。轻弹管壁而不要在涡旋仪上振荡,以促进 DNA 溶解。通过光谱吸收测 DNA 浓度。

        13. 用限制性内切核酸酶消化 DNA。

        14. 用 PFGE 分析消化的 BAC DNA。电泳要采用适宜大小的 DNA 标准参照物。

        来源:丁香实验

        ad image
        提问
        扫一扫
        丁香实验小程序二维码
        实验小助手
        丁香实验公众号二维码
        扫码领资料
        反馈
        TOP
        打开小程序