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        细菌人工染色体的应用

        相关实验:细菌人工染色体的应用

        最新修订时间:

        原理

        细菌人工染色体(bacterial artificial chromosome, RAC ) 是以大肠杆菌致育因子 (fertility, F)为基础的合成载体。

        材料与仪器

        步骤

        一、材料

        1. 缓冲液与溶液

        LB 冷冻缓冲液

        2. 酶与缓冲液

        限制性内切核酸酶

        3. 凝胶

        脉冲场凝胶电泳仪

        4. 培养基

        含 12.5 μg/ml 氯霉素的 LB 琼脂平板

        含 12.5 μg/ml 氯霉素的 LB 培养基

        5. 专用设备

        电穿孔仪

        6. 载体与菌株

        BAC DNA 或 BAC 分离物转化的大肠杆菌培养物

        冷冻的电转感受态大肠杆菌细胞

        二、方法

        1. 制备新鲜的 BAC 转化子。

        (1) 如果 BAC 是以 DNA 的形式提供的

        ① 用电穿孔法将 BAC DNA 导入大肠杆菌(DH10B 菌株)中。

        ② 从每批电穿孔后的菌液分别取出 2.5、25 和 250 μl,涂布于含 12.5 μg/ml 氯霉素的 LB 琼脂平板上。37℃ 温育平板 16~24 h。

        (2) 如果 BAC 是以转化菌液的形式提供的

        ① 立即在含 12.5 μg/ml 氯霉素的 LB 琼脂平板上划线培养。

        ② 37℃ 温育 12~16 h。

        2. 挑选 12 个转化菌落,分别加入 5 ml 含 12.5 μg/ml 氯霉素的 LB 培养基中。37℃ 剧烈振摇过夜。

        3. 在每 12 管 5 ml 培养液中各取 1 菌环,分别接种于 LB 冷冻培养基中培养。待细菌生长后,转移至 -20℃ 冷冻保存。

        4. 从步骤 2 每个 5 ml 菌液中取 4.5 ml,纯化 BAC DNA。

        5. 分析 BAC DNA

        (1) 用 PCR 法或用 SouAem 杂交鉴定 BAC 含有染色体的目的区域。

        (2) 用限制酶切和 PFGE 检测插入片段的大小。

        6. 根据检测结果,选一个或多个 BAC 作进一步分析。

        来源:丁香实验

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