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        通过免疫共沉淀确定结合蛋白实验

        相关实验:免疫共沉淀确定结合蛋白实验

        最新修订时间:

        材料与仪器

        步骤

        材料

        缓冲液和溶液
        将贮存液稀释到适当浓度

        乙腈(50%)

        考马斯亮蓝 R-250

        EBC 裂解缓冲液
        50 mmol/L Tris-Cl(pH8.0)
        120 mmol/L NaCl
        0.5%(V/V) Nonidet P-40
        5ug/ml 白胃素
        10ug/ml 抑肽酶
        50ug/ml PMSF
        0.2 mmol/L 正钒酸纳
        100 mmol/L 氯化纳

        NETN
        20 mmol/L Tris-Cl(pH8.0)
        1 mmol/L EDTA
        100 mmol/L 氯化钠
        0.5%Nonidet P-40

        NETN, 含 900 mmol/LNaCl

        磷酸盐缓冲溶液

        1xSDS 凝胶加样缓冲液

        三氟乙酸(TFA)(0.1%,m/V, 测序级)

        酶及缓冲液

        胰蛋白酶
        在 200 mmol/L 碳酸氢铵(pH8.9)(测序级,Boehringer Mannheim 公司)溶液中制备 250ug/ml 的牛胰蛋白酶

        胰蛋白酶消化缓冲液
        0.02%(V/V) 吐溫-20
        200 mmol/L 碳酸氢铵(pH8.9)

        抗体

        沉淀靶蛋白的抗体

        对照抗体

        凝胶

        不连续的 SDS-PAGE 梯度胶
        分离胶(pH8.8 的 7.5%~15% 不连续胶)应为 20~30 cm 长,浓缩胶(pH6.8 的 5% 胶)应为 10 cm 长,孔本身应为 1~2 cm 深(胶的百分浓度会随目的蛋白而有所不同)。倒浓缩胶时不用多孔梳子,通过在玻璃板间垂直插入垫片来制作加样孔,这样可以形成足够大的加样孔。关于 SDS-PAGE 的详情请见附录 8。

        专用设备

        沸水浴

        蛋白质 A-Sepharose
        在 NETN 缓冲液中制备 1:1 悬浮的蛋白质 A-Sepharose

        平板摇台

        附加试剂

        此方案的步骤 10 和 11 需要肽谱分析、肽纯化和测序的试剂和仪器(请见 Spector et al.1998,62 和 63 章)

        细胞和组织

        培养基中生长的适宜细胞株

        方法

        重要:这一方案是用于确定 pVHL 结合蛋白。对目标蛋白应当进行条件优化。

        1. 用磷酸盐缓冲液洗 30 块 10 cm 培养板上的适宜细胞(总共约 6X107 个细胞)。刮去每块板上的细胞到 1 ml 冰冷的 EBC 裂解缓冲液中。

        2. 将每毫升细胞悬液转移到微量离心管中,在微量离心机上 4°C 以最大速度离心 15 min。

        3. 收集上清(约 30 ml) 并加入 30ug 的适当抗体,4°C 摇动免疫沉淀物 1h。

        4. 加入 0.9 ml 的蛋白质 A-Sepharose 悬液,4°C 再摇动免疫沉淀物 30 min。

        5. 用含 0.9 mmol/LNaCl 的 NETN 洗蛋白 A-Sepharose 混合物,再重复洗 5 次。最后,用 NETN 洗一次。

        6. 吸出混合物的液体部分。加入 800ul 的 1XSDS 胶加样缓冲液到球珠中,煮沸 4 min。

        7. 将样品加入到大孔的不连续 SDS-PAGE 梯度胶中,在 10mA 的恒定电流下电泳过夜。

        8. 通过考马斯蓝染色观察蛋白质泳带(附录 8)。

        9. 从胶上切下目标带,将其放到微量离心管中,用 1ml 50% 乙腈洗两次,每次 3 min。

        10. 用胰蛋白酶消化胶中的蛋白质,再将肽电洗脱。

        a. 将胶条移到一个清洁的表面,让它不完全干。

        b. 加 5ul 胰蛋白酶消化缓冲液和 2ul 胰蛋白酶溶液。

        c. 在胶吸附胰蛋白酶溶液后,每次加 5ul 的胰蛋白酶缓冲液,直到胶条恢复到最初的大小。

        d. 将胶条置于微量离心管中,浸泡在胰蛋白酶消化缓冲液中并在 30°C 孵育 4 h。加入 1.5ul 的 0.1% 三氟乙酸终止反应。
        蛋白质的观察和消化步骤变化很大。事实上,蛋白质还在聚丙烯酰胺凝胶中时,或蛋白质转移到硝酸纤维素或 PVDF 胰上后,都可进行消化。

        11. 通过窄孔高效液相色谱分离肽。将收集的肽在 ABI477A 或 494A 机器上进行自动 Edman 降解测序。
        供序或 Edman 分析的样品处理也有变化,最好与操作仪器的人讨论。对方法的评述,请见 Matsudaira(1993)、Link(1999) 及 Spector 等(1998, 第 62 和 63 章)的文献。

        来源:丁香实验

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