从大规模裂解物中制备λ噬菌体颗粒实验

从大规模培养物中制备的 λ 噬菌体，可在高盐存在下用聚乙二酵 ( PEG ) 沉淀的办法从裂解物中回收得到。残余的细胞碎片和 PEG 可用氯仿抽提。在进一步纯化之前，建议测定噬菌体制备物的得率。

一、材料

1. 缓冲液和溶液

氯仿，NaCl ( 固体），聚乙二醇（PEG 8000)（每 500 ml 培养物大约用 50 g），SM。

2. 酶和缓冲液

  胰 DNase Ⅰ ( 1 mg/ml)，胰 RNase ( 1 mg/ml ) 于 TE 中（pH 7.6 )。

3. 离心机和转子

Sorvall GSA 转子或相当型号。

4. 专用设备

量筒（2 L)。

5. 载体和菌株

大肠杆菌培养物，经 λ 噬菌体感染和裂解。

二、方法

用 PEG 沉淀噬菌体颗粒

1. 将含有 λ 噬菌体的裂解培养物冷却至室温，加胰 DNase Ⅰ 和 RNase 至终浓度均为 1 μg/ml，室温温育 30 min。

2. 每 500 ml 培养物加入 29.2 g 固体 NaCl（终浓度为 1 mol/L)，搅拌使其溶解。将培养物冰浴 1 h。

再用 PEG 沉淀噬菌体颗粒中，NaCl 的加入促进了噬菌体颗粒与细胞碎片之间的分离，因此是有效沉淀所需的。一些研究人员喜欢在加入 PEG 的同时加入 NaCl，那样的话步骤 3 的离心过程可被省略。但需要告知的是，只有当噬菌体生长良好且其在最初裂解培养物中的滴度大于 2X10¹⁰ pfu/mI 时，PEG 和 NaCl 的同时加入才能有效地沉淀噬菌体颗粒。

3. 4℃，11000 g ( 8300 r/min 于 Sorvall GSA 转子中）离心 10 min 以去除细胞碎片，将四份培养物的上清混合置于 2 L 的干净量筒中。

4. 测定所收集上清的总体积，然后转移至 2 L 的烧瓶中，加固体 PEG 至终浓度为 10% (m/V，如 500 ml 上清加 50 g PEG)，于室温用磁力搅拌器慢慢搅拌溶解 PEG。

5. 将噬菌体/PEG 溶液转移至聚丙烯离心管中，于冰水浴冷却，至少放置 1 h 以便使噬菌体颗粒发生沉淀。

6. 4℃，11000 g ( 8300 r/min 于 Sorvall GSA 转子中）离心 10 min 以回收沉淀的噬菌体，去上清，将离心管倒过来倾斜放置 5 min，以便使剩余液体充分流干。用移液器吸去残余的液体。

用氯仿抽提细菌碎片

7. 用一带橡皮球的宽口吸管将噬菌体沉淀轻轻地重悬于 SM 中（针对步骤 3 每 500 ml 上清加 8 ml SM)，将离心管倾斜放置，使 SM 完全覆盖并浸泡噬菌体沉淀，室温放置 1 h。

彻底但温和地冲洗整个离心管壁，因为噬菌体沉淀会黏附在管壁上，尤其当离心管比较陈旧有凹痕时。而如果剧烈地吸取噬菌体，容易造成其尾部的断裂。

8. 通过加入等体积的氯仿抽提噬菌体悬浮液中的 PEG 和细胞碎片，温和振荡 30 s。4℃，3000 g（4300 r/min 于 Sorvall GSA 转子中）离心 15 min 以分离有机相和亲水相，回收含噬菌体颗粒的亲水相。

为了测定得率，用凝胶电泳分析噬菌体悬浮液。