溶解受体的凝集素亲和层析实验

材料与设备

麦胚凝集素（WGA)-琼脂糖（~2.5 ml 沉积的微球）（Vector Laboratories,Inc.ALI023 或 EY Laboratories,Inc.A2101)

溶解的胰岛素受体（得自实验 2)

一次性小型塑料柱（Bio-Rad Laboratories）

牛血清白蛋白（BSA,1%)

[125I] 胰岛素（受体级）（DuPont NEN NEX 196)

猪胰岛素〔17.5umol/L(0.1 mg/ml)，于 0.001mol/L HCl 中〕（Sigma Chemical Co.I3505)

牛γ-球蛋白（0.4%, 于醇液 B 中）（Miles Laboratories,Inc，82-041-2)

聚乙二醇 6000(20% 水溶液）

试剂

溶液 D

溶液 E

结合缓冲液（溶解受体用）

(配方，见“试剂的配制”，PP.234?240)

操作程序

凝集素亲和层析

1) 用 25 ml 溶液 D 清洗 2.5 ml WGA-琼脂糖，去除未偶联的 WGA。

2) 将 10~15 mg 溶解的胰岛素受体（~5 ml) 与 2.5 ml 洗后的 WGA-琼脂糖混合，混合物在 4°C 下轻轻摇动 16 h 或室温 1 h。

3) 将琼脂糖倒入一次性小型塑料柱中，用 15 ml 溶液 D 淋洗。

4) 用 15 ml 溶液 E 洗脱胰岛素受体。分部收集 0.5-ml 组分，用微量蛋白测定法 (microprotdnassay）测定各组分的蛋白浓度。合并含蛋白浓度峰的组分；这通常可得到约 3 ml 0.3 mg/ml 的蛋白。
注：蛋白主峰通常在第 3~6 管组分即约 1/2 柱体积处，且峰形相当尖。应保持疑集累层析柱的试剂缓冲液和琼脂糖在相同的温度。使用不同温度的试剂，会产生气泡和引起柱内的不均-性，导致洗脱蛋白的分辨率下降。

胰岛素与部分纯化受体结合量的测定

1) 于微量离心管中建立如下反应体系:



A 管的结果给出总结合量，B 管的结果给出非特异结合量。特异结合量=A 管的 cpm 值-B 管的 cpm 值。
注：购自 DuPont NEN 公司的受体级 [¹²⁵I] 胰岛素（NEX196) 的比活为 2200uCi/nmoL。胰岛素浓度为 35.5nmol/L。对于本试验，必须将 [_¹²⁵I] 胰岛素储液用缓冲液（50 mmol/L HEPES、0.1%Triton X-100、0.1% BSA,pH7.4) 稀释至 5nmol/L 对于部分纯化的受体来说，结合试验所需 [¹²⁵I] 胰岛素的终浓度应为 500pmol/L, 这在 300-ul 反应体系中相丧于 30ul 5nmol/L 的溶液。

2) 上述反应体系 4℃孵育 16 h，或室温赋育 2 h。

3) 沉淀法将受体结合的胰岛素与游离的胰岛素分开。加 75ul 0.4% 牛γ-球蛋白，4℃ 孵育 5 min。再加 375420% 聚乙二醇 6000，4℃ 孵育 10 min。

4) 混合物用微型离心机离心 10 min，收集沉淀物。

5) 尽量去除各管上清后，计数测定沉淀物的放射性强度。

结果

用 WGA-琼脂糖亲和层析纯化溶解胰岛素受体的典型结果，如图 4-5 和表 5 所示。