聚乙二醇沉淀法纯化质粒DNA实验

这种方法最早由 Richaed Treisman ( 英国，伦敦，ICRF) 参照 Lis 的工作而设计。Lis 是最早用聚乙二醇（PEG ) 分离不同大小 DNA 的人。Treisman 法被广泛用于碱裂解法制备的质粒 DNA 的纯化。

一、材料

1. 缓冲液和溶液

(1) 氯仿

(2) 乙醇

(3) 异丙醇

(4) LiCl ( 5 mol/L)

(5) PEG-MgCI₂ 溶液

(6) 酚：氯仿（1:1，V/V）

(7) 乙酸钠（3 mol/L, pH 5.2 )

(8) TE ( pH 8.0 )

(9) TE ( pH 8.0）含 20 μg/ml RNase A

2. 核酸和寡核苷酸

粗制质粒

3. 离心机和转头

Sorvall SS-34 或与其相当的转头

4. 专用设备

冰水浴

二、方法

1. 将 3 ml 粗制质粒转移到 15 ml Corex 管中，在冰浴中冷却至 0℃。

2. 加入 3 ml 冰预冷的 5 mol/L LiCl，混匀，于 4℃ 离心 12000 g ( Sorvall SS-34 转头，10000 r/min ) 10 min。

3. 转移上清至 30 ml Corex 管中，加等体积异丙醇，混匀，室温离心回收核酸，12000 g ( Sorvall SS-34 转头，10000 r/min ) 10 min。

4. 小心倒去上清，倒置管口，使液体流干。室温下用 70% 乙醇洗沉淀和管壁。小心将乙醇倒去，用真空抽吸器将管壁上残留的乙醇抽干。在纸巾上倒置数分钟，使无可见乙醇残留。但应使沉淀保持湿润。

5. 用 500 μl 含 RNase A 的 TE ( pH8.0 ) 溶解湿润的核酸沉淀。将溶液转移到微量离心管，室温放置 30 min。

6. 将质粒-RNase 混合物用酚：氯仿抽提一次，然后用氯仿抽提一次。

7. 用标准的乙醇沉淀法回收 DNA。

8. 将质粒 DNA 沉淀用 1 ml 灭菌水溶解，再加入 0.5 ml PEG-MgCl₂ 溶液。

9. 室温放置超过 10 min，然后于室温用微量离心机在最大速度离心 20 min, 以回收沉淀的质粒 DNA。

10. 沉淀用 0.5 ml 70% 乙醇重悬以去除微量 PEG, 用微量离心机在最大速度离心 5 min 以回收核酸。

11. 吸去乙醇，重复步骤10。第二次洗涤后，在离心管架上放置 10~20 min, 使乙醇挥发。

12. 湿润的质粒沉淀用 500 μl TE ( pH 8.0 ) 溶解。以 1:100 用 TE ( pH8.0）稀释后测 OD₂₆₀ 并计算质粒 DNA 的浓度。按 1OD₂₆₀ =50μg 质粒 DNA/ml 计算。

13. 分装 DNA 并保存于 -20℃。