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        PCR 组装反应

        相关实验:PCR 组装反应

        最新修订时间:

        材料与仪器

        步骤

        一、材料

        1. 缓冲液、溶液和试剂

        氯化镁,35 mmol/L

        Rockstart 缓冲液(http://klentaq.com)

        three-reaction 主混合液

        82ul 5mol/L 的甜菜碱

        3.2ul 每一种浓度为 10 mmol/L 的 dNTP 混合物

        1ul Klentaq LA 酶混合物(Clontech 8421-1)

        6.3ul 左侧 PCR riboprimer(储存液浓度10umol/L)

        6.3ul 右側 PCR riboprimer(储存液浓度 10umol/L)(没有模板)

        153.5ul H20 补至总体积 252ul

        2. 凝胶

        琼脂糖凝胶,1.4%

        3. 特殊设备

        PCR 仪

        PCR 管

        二、方法

        1. 向 3 个 PCR 管中都加入 10ul Rockstart 缓冲液和 10ul 35 mmol/L 的 MgCl2,让加入成分静置混合至少 15 min 以形成镁沉淀(BarnesandRowlyk2002)。

        2. 准备 three-reaction 主港合液。

        3. 在铁沉淀形成之后,向每个包括 Rockstart 沉淀的反应管中添加 80ul 的 three-reaction 主混合液。

        4. 加入PCR 组装反应 1ul 或2ul的 40mer 的混合物,浓度是每种 40mer lpmol/ul。混合与否并不重要。以 93°C 1 min、62°C 20 min 进行 25 个循环。

        5. 在 1.4% 的琼脂糖凝肢电泳分析 15ul 的 PCR 产物。

        来源:丁香实验

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