多元实时 PCR 实验

一、材料

1. 缓冲液、溶液和试剂

以50ul反应体系为例。

Platinum Quantitative PCR Super Mix-UDG(Invitrogen11730-025)         25ul

ROX染料（Invitrogen12223012)                                                        1ul

灭菌的蒸馏水（Gibco15230-162)                                                      10ul

10umol/L反向引物I                                                                              1ul

10umol/L正向引物I                                                                              1ul

10umol/L反向引物II                                                                             1ul

10umol/L正向引物II                                                                             1ul

小计                                                                                                    40ul

溶于0.1XTE或无菌水的模板                                                                10ul

总计                                                                                                     50ul

2. 专门的仪器

ABIPrism7700型号系列检测系统。

二、方法

1.PCR循环时的温度条件与方案2相同

典型的多元扩增结果见图15-3(见封二彩图)。实验以白介素-4 为目的基因，以肌动蛋白基因（看家基因）为参照基因。结果表明，当β-肌动蛋白基因为 10⁶ 拷贝数时，对白介素-4 的定量范困为 22~3X15 拷贝。对 PCR 条件没有进一步优化，体系中试剂的浓度与一元扩增时的完全相同。以防实时 PCR 效率下降，可以按照下面步骤对 PCR 体系进行优化。

2. 优化多元反应的条件

a. 对于高风度基因（特别是看家基因）其引物浓度可以降低到其他基因引物浓度 1/4。

b.MgCl₂ 浓度从 3 mmol/L 升到 6 mmol/L。

c. 每种 dNTP 浓度提高到 400umol/L。

d. 聚合酶的酶量加倍（反应体系中每 1ul 为 0.06U)。也可以使用 PlatinumTaqDNA 优质聚合酶（Invitrogen10966-018)。