相对 RT-PCR: 样品定量实验

一、材料

1. 缓冲液、溶液和试剂

去除 RNA 酶的双蒸水

10XRT-PCR 缓冲液（100 mmol/LTris-HCl、pH8.3，500 mmol/LKCl,15 mmol/LMgCl₂)

2. 酶和酶缓冲液

MMLV 逆转录酶（100-200U/ul)

SUPERaseINRNA 酶抑制剂（20U/ul;Ambion)

Taq DNA 聚合酶（5U/ul)

3. 核酸和寡核苷酸

总 RNA(每个样品达到 2.5ug)

随机引物（50umol/L)

dNTP 混合物（10 mmol/L，包含所有四种 dNTP)

基因特异的正向引物（5umol/L)

基因特异的反向引物（5umol/L)

4. 放射性复合物

[a^-32P]dCTP(10uCi/ul)(lCi=37 GBq)

5. 实验器材

Quantu mRNA Universal 18S standards (Ambion; 包括 18S PCR 引物对和 18S PCR 竞争子）

薄壁的 PCR 管

专用仪器

可编程的 PCR 仪

二、方法

1. 如方案 1 所述，集中运行单链 cDNA 合成反应，决定所有犇品的线性范围时使用同样量的 RNA。

2. 在冰上准备 PCR 反应混合物。

10XRT-PCR 缓冲液                                           50ul
 
10 mmol/LdNTP 混合物                                     40ul

5umol/L 基因特异的正向引物                             20ul

5umol/L 基因特异的反向引物                             20ul

18S rRNA 引物和竞争子（以方案 2 决定的比例添加）       40ul

5U/ulTaq DNA 聚合酶 rk;                                    2.5ul

[a-32P]dCTP(10uCi/Hl)                                       5ul

去除 RNA 酶的双蒸水                                    312.5ul

3. 在 9 个薄壁 PCR 管中分别添加 49ul 的 PCR 反应混合物。

4. 加 1ulddH20 于不加模板的对照管中。

5. 加1ul 每种样品 RNA 到相应的非反转录对照管中。

6. 加 1ul 从第一步 cDNA 合成反应中得到的每种样品的 cDNA 到相应的管中。

7. 做 PCR, 如方案 1 所述，使用扩增线性范围决定的最佳循环数。

8. 如方案 1 所述，用变性凝肢电泳来分析实验结果。不加模板的对照和非反转录对照应没有 PCR 产物产生。定置样品 PCR 产物的相对含量，可以用基因特异性产物的信号除以 18S rRNA 的信号，从而可以得到每个样品中基因特异产物的准确相对值，这些值可以用来比较样品间模板 RNA 的相对表达量。用样品 1 的标准化信号/样品 2 的标准化信号可以得到一个比值，以倍数或百分比表示。相对定量 RT-PCR 的实例见图 13-4。