原理
PAT法 [ PCR poly(A) test ] 可以快速、灵敏地从总 RNA 中分析特异 mRNA，而且可以定量估算 RNA poly(A) 尾长度。这方法中，包括 cDNA 合成的整个操作过程都在一个反应管中完成，不仅操作更简便，也减少了可能存在的 RNase 污染。尤其是 PAT cDNA 合成后非常稳定，并可重复使用，该方法的易操作性及灵敏度使其可以在任何系统中分析 poly(A) 尾的长度，目前已成功应用于鼠卵母细胞、果蝇卵母细胞和肝胎、线虫、酵母及培养细胞中 poly(A) 的分析。
材料与仪器
步骤
一、材料与设备
1. PAT cDNA 制备
(1) DEPC 处理蒸馏水。
(2) 高浓度T4 DNA 连接酶（10 Weiss U/L）。
(3) 无 RNase H Superscript Ⅱ 反转录酶（RT) ( Life Technologies，Gairhersburg，MD，USA ) ( 200 U/μl )。
(4) 5 X Superscript Ⅱ RT 缓冲液。
(5) 0.1 mol/L DTT，DEPC 水配制。
(6) 10 mmol/L ATP，DEPC 水配制。
(7) 40 mmoI/L dNTP ( 10 mmol/L dATP、10 mmol/L dTTP、10 mmol/L dCTP、10 mmol/L dGTP)，DEPO-H2O 配制。
(8) p[dT]12-18注意寡[dT]12-18必须被磷酸化 ]，10 ng/μl。
(9) 寡聚（dT ) 锚引物（5'-GCG AGC TCC GCG GCC GCG T12）200 ng/μl ( 也可以使用其他 3' 端具有寡聚 dT 延伸（n>10 ) 并且 5' 富含 GC 的寡核背酸作为 PCR 引物），DEPC 水配制，所有上述酶及溶液均保存于 -20℃ 。
2. PCR 反应
(1) 40 mmol/L dNTP ( 10 mmol/L dATP、10 mmol/L dTTP、10 mmol/L dCTP、10 mmol/L dGTP)，DEPC 水配制。
(2) 寡聚（dT ) 锚引物 200 ng/μl 水配制。
(3) mRNA 特异引物，溶于蒸馏水。
(4) Taq DNA 聚合酶。
(5) 10X Taq DNA 聚合酶缓冲液。
二、操作方法
1. PAT cDNA 制备
(1) 从组织或细胞中提取总 RNA 溶于 DEPC 水中，取 5 μl 加入无 RNase 的微量离心管中。
(2) 加入 2 μl (20 ng) p[dT]12-18 至每个 RNA 样品中，RNA 和 p[dT]12-18 的总体积为 7 μl。
(3) 加热到 65℃，变性 5~10 min。
(4) 立即将反应管置于 42°C 水浴中，注意动作要迅速，以避免 p[dT]12-18 与最未端 poly(A) 尾退火。
(5) 加入 13 μl 预热至 42°C 的 下列混合物，用吸头吹打混匀，置 42℃ 孵育 30 min。对于所有 PAT 反应，预先混合所有相同组分，对于每一个反应，应加入：4 μl 5X Superscript II RT 缓冲液，2 μl 0.1 mol/L DTT，1 μl 40 mmol/L dNTP 混合物，1 μl 10 mmol/L ATP， 4 μl DEPC 处理水，1 μl T4 DNA 连接酶 10 Weiss U/μl。
(6) 孵育后，反成物仍保温于 42℃ ，加入 1 μl (200 ng ) 寡聚（dT) 锚引物。混匀，快速离心，12℃ 孵育 2 h。
(7) 将反应管置于 42℃ 孵育 2min。
(8) 加入 1 μl 无 RNase H Superscript II 反转录酶，混匀，置于 42°C 孵育 1 h。
(9) 加热 20 min，使反转录酶和连接酶失活，PAT cDNA 可根据需要进行稀释。
2. PCR 反应
(1) 25~50 μl 标准反应体系包括：1X 缓冲液 [ 50 mmol/L KCl，10 mol/L Tris-HCl ( 25°C 时 pH 9.0 )，0.1% Triton X-100，1.5 mmol/L MgCl2 ]，0.2 mmol/L dNTP，0.5 μmol/L 模板特异引物，0.5 μmol/L 寡聚（dT) 锚引物，0.5~1.0 U Taq DMA 聚合酶， 0.5~1.0 μl PAT cDNA 作为模板。
(2) 扩增 500 bp 长片段建议使用的循环条件：93°C 变性 5 min，93°C 变件 30 s，57~65°C 复性 1 min，72℃ 延伸 1 min，最后 72°C 延伸 7 min。
(3) 可以取一小部分扩增产物，利用限制性内切核酸酶完全消化分析 3' 末端。
(4) 用凝胶电泳分析扩增产物。
1. PAT cDNA 制备
(1) DEPC 处理蒸馏水。
(2) 高浓度T4 DNA 连接酶（10 Weiss U/L）。
(3) 无 RNase H Superscript Ⅱ 反转录酶（RT) ( Life Technologies，Gairhersburg，MD，USA ) ( 200 U/μl )。
(4) 5 X Superscript Ⅱ RT 缓冲液。
(5) 0.1 mol/L DTT，DEPC 水配制。
(6) 10 mmol/L ATP，DEPC 水配制。
(7) 40 mmoI/L dNTP ( 10 mmol/L dATP、10 mmol/L dTTP、10 mmol/L dCTP、10 mmol/L dGTP)，DEPO-H2O 配制。
(8) p[dT]12-18注意寡[dT]12-18必须被磷酸化 ]，10 ng/μl。
(9) 寡聚（dT ) 锚引物（5'-GCG AGC TCC GCG GCC GCG T12）200 ng/μl ( 也可以使用其他 3' 端具有寡聚 dT 延伸（n>10 ) 并且 5' 富含 GC 的寡核背酸作为 PCR 引物），DEPC 水配制，所有上述酶及溶液均保存于 -20℃ 。
2. PCR 反应
(1) 40 mmol/L dNTP ( 10 mmol/L dATP、10 mmol/L dTTP、10 mmol/L dCTP、10 mmol/L dGTP)，DEPC 水配制。
(2) 寡聚（dT ) 锚引物 200 ng/μl 水配制。
(3) mRNA 特异引物，溶于蒸馏水。
(4) Taq DNA 聚合酶。
(5) 10X Taq DNA 聚合酶缓冲液。
二、操作方法
1. PAT cDNA 制备
(1) 从组织或细胞中提取总 RNA 溶于 DEPC 水中，取 5 μl 加入无 RNase 的微量离心管中。
(2) 加入 2 μl (20 ng) p[dT]12-18 至每个 RNA 样品中，RNA 和 p[dT]12-18 的总体积为 7 μl。
(3) 加热到 65℃，变性 5~10 min。
(4) 立即将反应管置于 42°C 水浴中，注意动作要迅速，以避免 p[dT]12-18 与最未端 poly(A) 尾退火。
(5) 加入 13 μl 预热至 42°C 的 下列混合物，用吸头吹打混匀，置 42℃ 孵育 30 min。对于所有 PAT 反应，预先混合所有相同组分，对于每一个反应，应加入：4 μl 5X Superscript II RT 缓冲液，2 μl 0.1 mol/L DTT，1 μl 40 mmol/L dNTP 混合物，1 μl 10 mmol/L ATP， 4 μl DEPC 处理水，1 μl T4 DNA 连接酶 10 Weiss U/μl。
(6) 孵育后，反成物仍保温于 42℃ ，加入 1 μl (200 ng ) 寡聚（dT) 锚引物。混匀，快速离心，12℃ 孵育 2 h。
(7) 将反应管置于 42℃ 孵育 2min。
(8) 加入 1 μl 无 RNase H Superscript II 反转录酶，混匀，置于 42°C 孵育 1 h。
(9) 加热 20 min，使反转录酶和连接酶失活，PAT cDNA 可根据需要进行稀释。
2. PCR 反应
(1) 25~50 μl 标准反应体系包括：1X 缓冲液 [ 50 mmol/L KCl，10 mol/L Tris-HCl ( 25°C 时 pH 9.0 )，0.1% Triton X-100，1.5 mmol/L MgCl2 ]，0.2 mmol/L dNTP，0.5 μmol/L 模板特异引物，0.5 μmol/L 寡聚（dT) 锚引物，0.5~1.0 U Taq DMA 聚合酶， 0.5~1.0 μl PAT cDNA 作为模板。
(2) 扩增 500 bp 长片段建议使用的循环条件：93°C 变性 5 min，93°C 变件 30 s，57~65°C 复性 1 min，72℃ 延伸 1 min，最后 72°C 延伸 7 min。
(3) 可以取一小部分扩增产物，利用限制性内切核酸酶完全消化分析 3' 末端。
(4) 用凝胶电泳分析扩增产物。
来源：丁香实验
