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        方案19.2 荧光检测支原体

        相关实验:荧光检测支原体

        最新修订时间:

        原理

        在无抗生素情况下,至少将细胞培养一周,将培养上清转移至处于对数生长早期的指示细胞中,孵育 3~5d ,将细胞固定和染色,寻找细胞核之外的荧光。

        材料与仪器

        步骤

        1. 将指示细胞(如 3T6,NRK,Vero,A549)接种于培养皿(6 cm 直径)中,不要使用抗生素,接种的细胞数可以在 4~5 天产生 50%~60% 的汇合层就足够了(如 2×104 NRK或 1×105 A549 在 5 ml 培养液中)。

        2. 加入来自所测试培养物的 1.5 ml 培养液。

        3. 将上述培养物进行孵育直至细胞达到 50%~60% 汇合。

        4. 移去培养液,并废弃之。

        5. 用 BSS-PR (无酚红的 Hanks’BSS)或 D-PBSA (无 Ca2+,Mg2+ 的 Dulbecco’sPBSA)冲洗单层培养物,将冲洗液废弃。

        6. 加入新鲜 BSS-PR 或 D-PBSA 按 50:50 的比例用固定液(新鲜制备的冰醋酸:甲醇(1:3,置冰上))稀释,冲洗单层培养物,废弃冲洗液。

        7. 加入纯固定液,冲洗,废弃冲洗液。

        8. 加入更多固定液(约 0.5 ml/cm2),固定 10 min。

        9. 移去固定液,并将固定液废弃。

        10. 如果准备贮存,则将单层培养物完全干燥(可在这个阶段积累标本,以后再染色)。

        11. 如果你要直接进行染色,可用去离子水冲洗,并废弃冲洗液。

        12. 在 BSS-PR 或 D-PBSA 溶液中加入 Hoechet 33258(Hoechst 33258 染料,50 ng/ml 溶于未加入酚红的 BSS (BSS-PR)或 D-PBSA),在室温下染色 10 min 。

        13. 移去染色液,并将其废弃。

        14. 用水冲洗单层培养物,废弃冲洗液。

        15. 加一滴封固剂(缓冲液配制的甘油溶液)封固盖玻片,擦去来自盖玻片边缘的多余封固剂。

        16. 用 330/380 nm 激光滤片和 LP 440 nm 屏障滤片,对单层培养物进行荧光检査。

        注意事项

        如果培养物在测定结束前达到完全汇合, 染色将被抑制, 支原体的观察很困难。

        来源:丁香实验

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