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        Caspase-3 活性的检测

        最新修订时间:

        原理

        Caspase 家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用, 其中caspase-3 为关键的执行分子,它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。Caspase-3 正常以酶原(32KD)的形式存在于胞浆中,在凋亡的早期阶段,它被激活,活化的Caspase-3 由两个大亚基(17KD)和两个小亚基(12KD)组成,裂解相应的胞浆胞核底物,最终导致细胞凋亡。但在细胞凋亡的晚期和死亡细胞,caspase-3 的活性明显下降。
         

        材料与仪器

        步骤

        一、Western blot 分析Procaspase-3 的活化,以及活化的Caspase-3 及对底物多聚(ADP-核糖)聚合酶[poly(ADP-ribose)polymerase,PARP]等的裂解。

        方法:收集细胞→PBS 洗涤→抽提细胞裂解液→蛋白定量→SDS-PAGE 电泳→硝酸纤维素膜或PVDF 膜转移→5 %脱脂奶粉封闭,室温1.5~2 h 或4 °C 过夜→Caspase-3 多抗或单抗室温反应1~2 h 或4 °C 过夜→TBS-T(含0.05% Tween 20的TBS)洗3 次,5~10 min/次→HRP-标记的羊抗鼠IgG 或AP 标记的羊抗鼠IgG室温反应1~2 h→ TBS-T 洗3 次, 5~10 min/次→ECL 显影或NBT/BCIP 显色。
         
        二、荧光分光光度计分析
         
        1.  原理:活化的Caspase-3 能够特异切割D1E2V3D4-X 底物,水解D4-X 肽键。根据这一特点,设计出荧光物质偶联的短肽Ac-DEVD-AMC。在共价偶联时,AMC不能被激发荧光,短肽被水解后释放出AMC,自由的AMC 才能被激发发射荧光。根据释放的AMC 荧光强度的大小,可以测定caspase-3 的活性,从而反映Caspase-3 被活化的程度。
         
        2.  方法:收获细胞正常或凋亡细胞,PBS 洗涤,制备细胞裂解液加Ac-DEVD-AMC(caspase-3 四肽荧光底物),37 °C 反应1 h,荧光分光光度计(Polarstar)分析荧光强度(激发光波长380 nm,发射光波长为430-460 nm)。
         
        三、流式细胞术分析
         
        方法:收获细胞正常或凋亡细胞,PBS 洗涤,加Ac-DEVD-AMC 37 °C 反应1 hUV 流式细胞计分析caspase-3 阳性细胞数和平均荧光强度。
         

        来源:丁香实验

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