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        DNA片断的酶切实验

        相关实验:DNA 片断的酶切实验

        最新修订时间:

        原理

        酶切指采用粘末端连接必须对目的DNA分子和载体分子进行酶切以获得相应的粘末端进行连接。

        材料与仪器

        步骤

        一、EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ单酶切及双酶切

        1.  取2支干净、灭菌新Eppendof管,分别按下表加入
         
          A(μl) B(μl)
        灭菌水 13 13
        EcoR Ⅰ缓冲液 2 0
        Hind Ⅲ缓冲液 0 2
        λDNA (或质粒DNA ) 4 4
        EcoR Ⅰ 1 0
        Hind Ⅲ 0 1
        总体积 20 20
        2.  37℃保温1-4小时。

        3.  保温结束后65-70℃10 min 灭活酶(如为热稳定性酶,则用氯仿抽提)。

        4.  取2 μl 左右的反应液加入2 μl 电泳加样缓冲液,电泳。
         
        二、EcoR Ⅰ、Hind III双酶切

        1.  取一支干净、灭菌Eppendof管,按下表加入各种试剂
         
        加入试剂 体积(μl)
        灭菌水 12
        MULT buffer 2
        λDNA(或质粒DNA) 4
        EcoR Ⅰ 1
        Hind Ⅲ   1
        总体积 20
         
        2.  37℃保温1-2小时。

        3.  保温结束后65-70℃10 min 灭活酶(如为热稳定性酶,则用氯仿抽提)。

        4.  取2 μl 左右的反应液加入2 μl 电泳加样缓冲液,电泳。

        注意事项

        1.  样品加入次序为水、缓冲液、DNA最后为酶,不应颠倒。

        2.  加酶步骤要在冰浴中进行,在加酶前应先将水、缓冲液及待切DNA混匀。

        3.  反应体积中水的量要尽量少,即反应体系的体积要尽量少,一般水解0.2~1 ug 模板DNA时,应将体积控制在20~30 ul 内。但要保证所加酶的体积不高于总体积的1/10,因为限制性内切酶是保存于50%甘油中的,如加酶体积高于总体积的1/10,则反应液中甘油浓度将大于5%,而此浓度将抑制内切酶活性。

        4.  为了控制反应体积和促进反应进行,要求模板DNA的浓度应很高,否则反应体系中DNA浓度太低则将引起酶反应动力学改变、降低酶解效果,此时不得不增加反应体积;而一般为了增加DNA储藏的稳定性,DNA多保存在TE缓冲液中,如反应体系中过多加入模板DNA溶液则势必造成反应体系中EDTA浓度升高,而对酶产生抑制。因此如底物DNA浓度过低则应进行浓缩。

        常见问题

        单酶切操作比较简单,但双酶切如果两种酶所用缓冲液成分不同(主要是盐离子浓度不同)或反应温度不同,这时可以采用如下措施解决:1)先用一种酶切,然后乙醇沉淀回收DNA分子后再用另外一种酶切;2)先进行低盐要求的酶酶切,然后添加盐离子浓度到高盐的酶反应要求,加入第二种酶进行酶切;3)使用通用缓冲液进行双酶切。具体要根据酶的反应要求进行,尽量避免活力损失。

        来源:丁香实验

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