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        【资源】实验三 质粒DNA的酶切

        丁香园论坛

        4717
        1.目的
        学会用限制性内切酶切割质粒DNA。
        2.原理
        II型限制性内切酶能识别双链DNA内部的特殊序列并在识别位点处将双链切断,形成粘性末端或齐平末端,通过电泳酶切后的DNA混合物能够确认和分离酶切片段。
        3.器材
        旋涡混合器,微量移液取样器,移液器吸头,1.5ml微量离心管,双面微量离心管架,水漂,恒温水浴。
        4.试剂
        Pinpoint™xa-3质粒,EcoR V,BamH I,内切酶缓冲液(10×),10×电泳加样缓冲液,荧光染料。
        5.实验准备
        配制TAE电泳缓冲液(50´储存液),10´加样缓冲液,1.5ml离心管装入铝制饭盒(灭菌)、移液器吸头装入相应的吸头盒(灭菌)。
        6.操作步骤
        (1)混合下列溶液于一个无菌的1.5ml微量离心管中:
        Pinpoint™xa-3 DNA (或pUCm-T-CHI ) 6 μl
        10×酶切缓冲液(用EcoRV的缓冲液) 2 μl
        ddH2O 30 μl
        EcoRV 1μl
        BamHI 1μl
        总体积 40μl
        (2)先准备一个冰盒并放入一定量的冰块。从-20℃冰柜中取出限制性内切酶,立即插入冰块中。
        (3)用一只手的手指捏在盛放酶的微量离心管的上部(以免手指的给酶液加温),另一只手持微量移液器,小心翼翼地吸取1 μl限制性内切酶。
        (4)在酶切样品混合液中加入限制性内切酶后(立即把内切酶原液送回冰柜!),轻轻震动微量离心管使管中的溶液混匀。再在离心机中1000rpm离心10秒。取出后插到水漂的孔中,在推荐的最适酶切温度水浴中温育1~3 h(一般是 37℃)。
        (5)酶切后取少量酶切产物与合适的已知分子量的DNA(如先前的PCR产物)对比电泳,以确认切下的片断是否为自己想要的片断。
        (6)酶切后的质粒可以回收备用(见实验六:从琼脂糖凝胶中回收DNA片段)。
        (7)清理桌面垃圾,清洗实验仪器。撰写实验报告。
        7.思考
        (1)酶切反应混合物的体积是否对酶切效果有影响?为什么?
        (2)如何估计DNA用量和酶的用量?
        (3)在吸取内切酶的时候如何操作才能避免浪费?
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