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        氯化铯法

        最新修订时间:

        原理

        提取DNA的一般过程是将分散好的组织细胞在含SDS(十二烷基硫酸钠)和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质,再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质,得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。

        材料与仪器

        实验材料
        试剂、试剂盒
        仪器、耗材

        步骤

        1.  培养100 ml 细菌培养物至饱和状态,用JA-20转子4 000 g 离心10 min。

        2.  用9.5 ml 的TE缓冲液重悬沉淀。

        3.  加0.5 ml 10%的SDS和50 ul 20 mg/ml 的蛋白酶K,混合,于37℃温育1 h。

        4.  加1.8 ml 5 mol/l NaCl,充分混合,加入1. 5 ml CTAB/NaCl溶液,混合,于65℃温育20 min。
         
        5.  加等体积的氯仿/异戊醇抽提,室温下6 000 g 离心10 min,用宽口吸管将上清液转移至新管中。
         
        6.  加化6体积的异丙醇,轻轻混合直至沉淀下来,用一个封口的巴斯德吸管将沉淀转移至70%乙醇中冼涤。
         
        7.  10 000 g 离心5 min,弃上清,用4 ml TE缓冲液重悬沉淀。

        8.  用分光光度计检测DNA的浓度,将其调节到50~100 ug/ml。

        9.  每4 ml 缓冲液加人4.3 g CsCl,并使之溶解,加入200 ul 的10 mg/ml 的溴化乙锭。

        10.  转移至4 ml 快封口离心管中,调节体积,用TE缓祌液配制的CsCl平衡离心管,封住管口。

        11.  用VTi80转子于15℃,以420 000 g 离心4 h或 250 000 g过夜。
         
        12.  在长波紫外灯下观察梯带,用15号针头和3 ml 塑料注射器移出条带。

        13.  用CsCl饱和的异丙醇或水饱和的丁醇离心抽提,以除去溴化乙锭。

        14.  在2 L TE缓冲液中透折过夜以除去CsCl,如果必要,沉淀DNA并重新溶解至所需要的浓度。

        来源:丁香实验

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