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        小量制备

        最新修订时间:

        原理

        提取DNA的一般过程是将分散好的组织细胞在含SDS(十二烷基硫酸钠)和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质,再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质,得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。

        材料与仪器

        实验材料
        试剂、试剂盒
        仪器、耗材

        步骤

        1.  培养5 ml 的细菌培养物至饱和状态,取1.5 ml 的培养物离心2 min。

        2.  沉淀物加入567 ul 的TE缓冲液,用吸管反复吹打使之重悬。

        3.  加入30 ul 10%的SDS和3 ℃ 20 mg/ml蛋白酶K,混匀,于37℃温育1 h。
         
        4.  加入100 ul 5 mol/l NaCl充分混匀,再加入80 ul CTAB/NaCl溶液,混匀,于65℃温育10 min。
         
        5.  加入等体积的氯仿/异戊醇,混匀,离心4~5 min将上清液转人一个新管中,如果难以移出上清,先用牙签除去界面物质。
         
        6.  加入等体积的酚/氯仿/异戊醇,混匀,离心5 min,将上清液转入一只新管中。
         
        7.  加入0.6体积异丙醇,轻轻混合直到DNA沉淀下来,用一个封口的巴斯德管将沉淀转移至1 ml 的70%乙醇中洗涤。
         
        8.  离心5 min,弃上清,用冻干机稍加干燥,重溶于的下100 ul  TE缓冲液,每次酶切反应用10~15 μl。

        来源:丁香实验

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