胰酶消化法

一、实验材料准备

1.  动物

出生后1-4天的Wistar乳鼠1只。
 

2.  试剂
 

PBS、培养液(Hyclone的低糖DMEM，含Hyclone的10%新生牛血清、100 U/ml 青链霉素、1%明胶PBS、0.25%胰酶(含EDTA，GIBCO)，碘酒和酒精绵球。
 

3.   器械

眼科直剪2把、眼科弯剪2把、眼科直镊2把、眼科弯镊2把、玻璃平皿3套，25 cm²塑料培养瓶(Costar)。

二、具体操作
 

1.   明胶包被培养瓶过夜(准备2-3个)，取出明胶，用2 ml培养液冲洗培养瓶一遍，置于超净台中。
 

2.  解剖取肺：将乳鼠在酒精中浸泡后取出，转移至超净台上的玻璃培养皿中，用碘酒消毒胸部皮肤，再用酒精棉球脱碘。左手捏紧乳鼠颈背部皮肤以充分展露胸部，右手以眼科直剪剪开皮肤，充分撕拉开，再用酒精棉球消毒，继而以另一把眼科弯剪沿胸骨柄左下缘向上剪开肋骨，然后在切口中间横剪胸骨。用眼科镊取出肺，置于盛有PBS(含有200 U/ml青链霉素)的玻璃平皿中，冲洗去血。
 

3.   用眼科剪将肺分成几个肺叶，用镊子去除周边的血凝块及纤维组织，用眼科剪剪去肺门处的支气管和血管，再用含有双抗的PBS冲洗1遍。
 

4.  用眼科弯剪将肺组织剪碎成1 mm³大小，加入含有双抗的PBS，将肺组织块吹打开，静置15 min后，更换新的PBS。
 

5.  用200 ul微量加样器(最好是超净台中专用的，临用时用酒精绵球好好擦拭枪柄)取200 ul加样枪头一个，剪去尖，在酒精灯上用火焰烧弯。用枪头吸取组织块接种于培养瓶中，每瓶20-25块左右，每小块间距0.5 cm左右。组织块放置好后，轻轻将培养瓶翻转，让瓶底朝上，向瓶内加入2 ml左右的培养液，盖好瓶盖，将培养瓶倾斜放置在温箱中，干贴壁2-4 h后，将培养瓶慢慢翻转平放，继续静置培养。注意上述操作过程中动作要轻柔，让液体慢慢覆盖组织小块，严禁动作过快致使液体产生的冲力使粘贴的组织块漂起而造成原代培养失败。48 h后换液，更换2-3 ml即可。
 

6.  贴块贴壁72 h后，镜下可见大量的成纤维细胞爬出，将组织块去除，继续培养2-3天，待细胞长满，即可传代。注：因为血清浓度低，内皮细胞可以爬出少量，但是很快就会死掉。
 

2.7 传代用0.25%胰酶常规消化，以1:2传代，传代完后，采用差速贴壁法纯化一次，即待细胞贴壁1.0 -1.5 h后(即绝大多数成纤维细胞都已经贴壁)，弃去未贴壁的细胞和培养液，更换新的培养液。

成纤维细胞为长梭形形态，常呈漩涡状生长。见下图：