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        磷酸钙法

        相关实验:磷酸钙法转染 HEK293T 细胞

        最新修订时间:

        原理

        常规转染技术可分为两大类,一类是瞬时转染,一类是稳定转染(永久转染)。前者外源DNA/RNA不整合到宿主染色体中,因此一个宿主细胞中可存在多个拷贝数,产生高水平的表达,但通常只持续几天,多用于启动子和其它调控元件的分析。一般来说,超螺旋质粒DNA转染效率较高,在转染后24-72小时内(依赖于各种不同的构建)分析结果,常常用到一些报告系统。

        材料与仪器

        步骤

        1. 铺细胞: 选择状态良好的293T细胞传代, 2-3x105个细胞/35mm dish。


        2. 20-24h后,待细胞长至铺满瓶底约50-70%的时候,进行转染。下面就35mm dish为例,采用以下转染体系:


        ddw: 105ul


        plasmid: 2ug (如0.5ug/ul, 即用4ul)


        2M CaCl2: 16.5ul


        2XHBS: 125ul


        按上述顺序,往eppendorf管中依次加入上述四种试剂。


        先将前三者混匀, 最后加2XHBS。


        一种方法是,加2XHBS时要逐滴加入, 吹打至微现乳白色, 立即均匀滴入培养皿,轻轻摇匀后置于培养箱中,6-8h后换液。


        另一种方法是, 加入2XHBS后立即吹打约40下(不过这个要根据每个人的力道和吹打的频率而定, 建议做一个梯度实验,吹打不同的次数看哪次的转染效率高以后就按这个次数来吹打), 之后步骤同上, 立即均匀滴入培养皿,轻轻摇匀后置于培养箱中,6-8h后换液。

        注意事项

        1.HBSP 缓冲液的 pH 值在 6 .70 和 7 .10 时转染HEK 293T 细胞的效果不好 ,细胞成活率低, 有大颗粒状物体存在;pH 值在 6 .96 时转染效果好,细胞存活率高, 蓝染细胞明显。


        2.未纯化的 lacZ-pShuttle 质粒转染 HEK 293T 细胞转染效率低, 细胞成活率很低,而纯化后的质粒转染效率高 ,蓝染细胞明显 。

        常见问题

        1.转染后培养 6h 进行甘油休克效果最佳,比培养 0h 直接进行休克转染效率升高584.4 %。


        2.甘油休克时间为4.5min 时转染效果最佳,比不用甘油休克转染效率升高 130.8 %。

        3.来源于论文《一种用磷酸钙法高效转染 HEK 293T 细胞方法的建立》,陈晓,蒋捍东,路新枝,于文功。

        来源:丁香实验

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