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        🔥 细胞毒性分析(CCK-8 法)

        相关实验:细胞毒性分析

        别名:CCK8,细胞毒性,CCK-8,MTT,Cell Counting Kit-8,细胞增殖检测

        最新修订时间:

        丁香实验推荐阅读

        合作专家 | 孙汉寅硕士

        生物与医药学 中国科学院大学

        丁香实验推荐阅读

        审核专家 | 李娜硕士

        生理学 大连医科大学

        简介

        细胞毒性是指由细胞或化学物质引起的单纯细胞杀伤事件,不依赖于凋亡或坏死的细胞死亡机理。 常用细胞毒性检测方法有 CCK-8 法、MTT 法、LDH 法。

        1、与 MTT 法相比:

        1)CCK-8 使用更为方便,无需洗涤细胞;
        2)CCK-8 法能快速检测;CCK-8 法的检测线性范围广,灵敏度更高;
        4)CCK-8 法的重复性更好,MTT 实验生成的 formazan 不是水溶性的,需要使用 DMSO 等有机溶剂溶解;CCK-8 法产生的formazan 是水溶性的,既省去了溶解步骤,又可以减少该操作步骤带来的误差;
        5)CCK-8 法对细胞毒性小,可以保持细胞原状态;CCK-8 法试剂价格较高;

        2、与 LDH 法相比:

        1)CCK-8 是加在细胞中,而 LDH 检测是细胞上清,这样细胞还可以用来做其他实验;
        2)LDH 法可进行高通量检测;

        原理

        以 CCK-8 法为例简述其原理:CCK-8 试剂盒中含水溶性四唑盐WST-8 (化学名:2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐),WST-8在电子载体1-Methoxy PMS存在的条件下,活细胞线粒体中的脱氢酶催化 WST-8 生成高度水溶性的橙黄色甲瓒燃料,而甲臜染料的生成量与活细胞的数量成线性关系。

        用途

        1、药物筛选实验;
        2、肿瘤药敏试验;
        3、生物活性因子的活性检测;
        4、细胞增殖测定等;

        材料与仪器

        步骤

        1、根据具体细胞类型确定其在 96 孔板种植密度,以对照组细胞密度至检测时达到 70%-90% 为参照,每组设置 3-6 个复孔,孔板边缘空不用,加入与培养基等体积的无菌 PBS 溶液;

        2. 每孔加入培养基体积 1/10 的CCK-8 溶液。若起始的培养体积为 200 微升,则需加入 20 微升 CCK-8 溶液,其它情况以此类推。同时以加了相同体积细胞培养液和 CCK-8 溶液但没有细胞的孔作为空白对照。若所用药物会干扰检测结果,则选加入等体积细胞培养液、药物和 CCK-8 溶液但无细胞的孔作为空白对照(注意不可产生气泡);

        3. 在细胞培养箱内继续孵育 2-4 小时,建议选取 2、3、4 小时后分别用酶标仪检测,然后选取吸光度范围比较适宜的一个时间点用于后续实验;

        4. 在 450 nm 测定吸光度。如无 450 nm 滤光片,可以使用 420-480 nm 的滤光片。可以使用大于 600 nm 的波长,例如 650 nm,作为参考波长进行双波长测定。

        注意事项

        1、本实验使用 96 孔板进行检测,周围一圈最容易蒸发,检测会因体积不准确而增加误差故弃用周围一圈,加入等体积相同量的PBS、水或培养液;

        2、本试剂盒的检测依赖于脱氢酶催化的反应,因而还原剂(例如一些抗氧化剂)会干扰检测,如果待检测体系中存在较多的还原剂,需设法去除。

        3、用酶标仪检测前需确保每个孔内没有气泡,否则会干扰测定;

        4、酚红和血清对 CCK-8 法的检测不会造成干扰,可以通过扣除空白孔中本底的吸光度而消去;

        5、试剂有一定的毒性,请穿好实验服并戴一次性手套操作;

        6、试剂要注意避光 4℃ 或 -20℃ 保存;

        常见问题

        1. 如果细胞生长较慢,且细胞较小,可以最大接种 1x10^4 cells/well,但加入化合物后处理时间最长为 72 h。

        2. 化合物如果难溶于水,可以在培养基中适当添加 DMSO、DMF 以助溶,但最大浓度不宜超过 0.5%,因为 DMSO 和 DMF 对细胞也有一定的毒性。如果使用 DMSO、DMF 助溶,需保证其他浓度的化合物 DMSO、DMF 的浓度也相同。

        3.若吸光度值太低,怎么办法?
        1)适当增加细胞数量;
        2)延长加入 CCK-8 溶液后的孵育时间。

        来源:丁香实验

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