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        密度梯度离心法(核酸提取)

        相关实验:核酸提取

        最新修订时间:

        材料与仪器

        步骤

        1. 在短中管中加入适量淋巴细胞分离液。

        2. 取肝素抗凝静脉血与等量Hank's液或RPMI1640充分混匀,用滴管沿管壁缓慢叠加于分层液面上,注意保持清楚的界面。水平离心2000rpm×20分钟。

        3. 离心后管内分为三层,上层为血浆和Hank's液,下层主要为红细胞和粒细胞。中层为淋巴细胞分离液,在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带(如下图),单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。此外,还含有血小板。

        4. 用毛细血管插到云雾层,吸取单个核细胞。置入另一短中管中,加入5倍以上体积的Hank's液或RPMI1640,1500rpm×10分钟,洗涤细胞两次。

        5. 末次离心后,弃上清,加入含有10%小牛血清的RPMI1640,重悬细胞。取一滴细胞悬液与一滴0.2%台盼兰染液混合,于血球计数板上,计数四个大方格内的细胞总数。

        6. 细胞活力检测:死的细胞可被染成兰色,活细胞不着色。计数200个淋巴细胞。计算出活细胞百分率。

        注意事项

        1. 抽取人外周静脉血时要注意无菌操作。

        2. 操作全程应尽可能短时间内完成,以免增加死细胞数。

        3. 用淋巴细胞分离液分离PBMC时,离心机转速的增加和减少要均匀、平稳,使保持清晰的界面。

        4. 小鼠、兔等动物淋巴细胞比重与人不同,犛&配制相应密度的Percoll或不同比例的聚蔗糖和泛影葡胺。

        来源:丁香实验

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