其他实验

成功的基因转导需要有效的转运和外源基因的长期存在，才能使生理相关和被恰当调控表达的治疗基因在受体祀细胞内得以维持。最佳的基因转运平台应该具有无限的有效载荷_ 力而且不与受体基因组整合。而且应该在受体细胞内形成自主复制元件，长期调控基因表达。尽管一些潜在的可行方法已经被开发，但是要满足上述要求，可能仍需要特定的、克隆的和有功能的染色体元件重新组装成人人工染色体（H A C ) 来达成。作者：T.弗里

在对动物细胞进行核酸转运和基因表达时常用的各种病毒或非病毒手段中，裸质粒D N A 技术具有许多优点。首先，质粒 D N A 可通过D N A 重组技术直接进行操作，对技术与设备无特殊要求！其次，此法即使用于大规模生产成本也不高；第三，由于质粒D N A 无免疫原性，所以可多次给药也不会诱导抗体产生（Jia〇et al.1992)。与人们通常认识相悖的是，即使外源基因没有整合于染色体，通过裸质粒D

RheoSwitch 系统是蜕皮激素受体基础上高效率的基因调节体系，该系统被合成的小分子配体激活。受体由蜕皮激素受体蛋白和R X R 蛋白以双杂交的形式异二聚体化组成 ，在配体存在下受体从相应的启动子激活转录。 RheoSwitch 系统在动物细胞、酵母和植物中行使功能。作者：T.弗里德曼等,译者：殷勤伟等，本实验来自「基因转移」

近几年，应 用 R N A 干 扰 技 术 （R N A i ) 进行的功能基因组研究开展得非常广泛。R N A i 在各种调节基因表达的技术中是最新的也是最成功的，这些技术一般都是以反义作用为基础的。要把反义效应因子导入细胞，有两种主要的方法：从细胞外导入已经合成的效应分子或通过适当的载体在细胞内表达效应分子。通过外源导人引起的基因表达下调是暂时的，不适合用于对半衰期较长的蛋白质的研究，而且转染

通过位点特异的D N A 重组改变完整细胞和有机体的基因组已经成为一种重要的基因转移方法。基因转移和同源重组引起的D N A 修饰一旦整合进目的基因组就不会再移动。与之相反，转移的D N A 片段如果包含外源重组酶目的序列，则可以进一步修饰之前发生变化的基因组结构，从而提高了基因转移的实用性，加强了实验的设计。作者：T.弗里德曼等,译者：殷勤伟等，本实验来自「基因转移」

将基因转移到细胞并表达新的蛋白质，或以此改变内源性蛋白质的表达水平，可以调节细胞的生理功能。这种方法对研究细胞功能十分有益，同时在大量疾病治疗方面具有良好的应用前景。因此，发展新型高效的非病毒D N A 传输体系非常重要。最近发现被称为多肽/蛋白质转导域（P T D ) 的一些阳离子短肤能有效地将包括D N A 在内的多种物质输送到各种细胞中。本章介绍表面提呈H I V -1 T A T P T

特 定 位 点 的 基 因 敲 除 和 非 病 毒 D N A 传 送 技 术 在 研 究 蛋 白 质 功 能 中 特 别 重 要 ，同时也 可 以 作 为 未 来 治 疗 的 手 段 。很 多 技 术 的 问 题 在 于 其 生 物 相 容 性 差 和 具 有 毒 性 ，特 别 是在 体 内 应 用 的 时 候 。某 些 阳 离 子 肽 可 以 移 位 穿 过 细 胞 膜 ，更 为 重 要 的

用 “睡 美 人 ” （sleeping b e a u ty , S B ) 转 座 子 高 效 输 送pol III驱 动 的 s h R N A 表 达 框 的 方 法 。这 一 体 系 的 优 点 包 括 它 用 标 准 的 质 粒 转 染 试 剂 方便 地 进 行 基 因 输 送 ，而 且 由 于 基 因 转 位 和 多 重 整 合 的 可 能 性 使 基 因 组 整 合 效 率 增 加

复 合 聚 乳 酸 -聚 羟 基 乙 酸 （P L G A ) 和 聚 乙 二 醇 （P E G ) 衍 生 物 的 纳 米 颗 粒 已 经 被用 作 为 透 黏 膜 的 基 因 载 体 。这 种 纳 米 载 体 的 优 势 来 源 于 其 固 有 的 生 物 可 降 解 性 、组 分 的低 毒 性 和 温 和 的 制 备 条 件 。此 外 ，在 体 内 应 用 时 ，还 有 以 下 的 优 点

发 展 安 全 有 效 的 基 因 传 输 系 统 是 确 保 临 床 基 因 治 疗 成 功 的 先 决 条 件 。尽 管 病 毒 载 体的 转 基 因 效 率 高 ，但 出 于 安 全 性 及 病 毒 免 疫 原 性 的 考 虑 ，研 究 人 员 开 始 寻 找 替 代 病 毒 的非 病 毒 载 体 材 料 （Nishikawa and H u a n g 2001; Check 2003)。

水泡性口炎病毒的外壳融合G蛋白（VSV-G) 可以用于制备假型反转录病毒和假慢病毒，这种糖蛋白也可以单独作为有效的基因转移载体。在没有其他病毒成分存在的情况下，经 VSV-G 表达质粒转染的细胞将 VSV-G 蛋白分泌到培养基中，并可以通过蔗糖层超速离心法将其部分纯化。作者：T.弗里德曼等,译者：殷勤伟等，本实验来自「基因转移」

纳米颗粒被广泛用于克服药物传递的屏障。与合成高分子相比，天然高分子纳米颗粒具有一些明显优势。本章描述用生物髙分子明胶制备纳米粒的方法及相关的体外细胞培养实验，具体包括用乙醇去溶剂化制备纳米粒以及包载DNA时的注意事项。通过包裹一些电子密集性材料(如金纳米粒)并利用透射电子显微镜(TEM)进行观察可以示踪纳米颗粒在细胞内的行为。本章将介绍蛋白质纳米球包载金纳米颗粒的制备方法、细胞培养和TEM 样品的

线性聚乙烯亚胺(L P E I )是适合大量细胞系和原代细胞的非常有效的转染试剂，它同样也适用于体内局部或系统基因输送。与许多其他非病毒转染方法不同，L P E I 对有丝分裂的依赖性低,而且可以转染分裂垮的细胞( B n m n e r et al.2002)。用 L P E I 的转染过程操作简单，转染中血清的存在(不 超 过 10%)并不会明显降低转染的效率v但却显著降低毒性，特别是对于原代

天然多糖作为基因输送的载体正被广泛研究。透明质酸 （H A ) 无炎症反应和无免疫原性的特点从临床应用角度讲显得尤为重要。此外，体内存在透明质酸酶，可促进透明质酸载体的降解。将 D N A 包载到交联的透明质酸材料中，在酶作用下可将透明质酸降解，从而释放携带 DNA 的 HA 片段。作者：T.弗里德曼等,译者：殷勤伟等，本实验来自「基因转移」

聚阳离子是一类有效的非病毒基因传递载体。这些载体因分子质量、化学结构、聚合物/DNA比例、分子结构而异，具备键合靶向基团的能力。这些载体能与不同的质粒复合，并将其转染至各种细胞中，从而高效地表达目的蛋白质。阳离子多糖是基因传递中很受关注的一类载体。这些多糖来源于天然或者半天然的材料，无毒性、可生物降解 、具有良好的生物相容，并且容易修饰从而改善其物理化学性质。作者：T.弗里德曼等,译者：殷勤伟等，

水溶性脂高分子和脂肽是一类非病毒基因载体，它结合了脂质材料增加D N A 对细胞膜的通透性以及聚阳离子与D N A 缩合并促进基因在内含体逃逸的特点。通过氯甲酸胆固醇醋与分子质量为1800D a 的支化聚乙烯亚胺（P E I ) 的初级或次级胺的化学反应制备脂高分子。将 C K i V -琥珀酰亚胺基)-iV， N , A T , J V -四甲基脲四氟硼酸酯(T S T U )与石胆酸在过量二异

P E G 化的聚左旋赖氨酸和D N A 的纳米颗粒是水溶性的，在生理盐水和组织液中稳定 存 在 ，转 染 不 分 裂 的 细 胞 （ Liu et al.2003)，显 示 很 小 的 毒 性 （ Ziady etal.2003b)，而且在动物体内和人体内都有效（K o nstanetaL 2004)。它们的制备方法简单可靠，具有可重复性。这些性能也代表了非病毒基因载体的基本优点。作者：T.弗里

固体脂质纳米颗粒（S L N ) 和阳离子脂质体以及阳离子聚合物等基因载体相比有很多技术上的优势。然而，在缺少溶内体试剂（如氯喹）的情况下，即 使 S L N 载体的组分经过优化，其基因转染效率仍然比使用标准转染试剂要低。本文通过在S L N 中掺入H I V -I 蛋白二聚体T A T 多肽来增加基因转染效率，结果显示掺人T A T 的 S L N 比标准转染试剂的转染效率高，而毒性降低。作者：

在 酵 母 细 胞 中 制 备 B 型 肝 炎 病 毒 （H B V ) 外 壳 L 蛋 白 时 ，形 成 中 空 的 生 物 纳 米 胶囊 （B N C ) , 通 过 电 穿 孔 技 术 ，可 使 它 装 载 40k b 以 内 的 质 粒 D N A 、小 干 扰 R N A 、药物以 及 蛋 白 质 等 。作 为 药 物 输 送 体 系 ，这 种 用 L 蛋 白 形 成 的 B N C 有

P E I 由于其聚阳离子的本质，它和带负电的D N A 分子通过静电相互作用形成纳米颗粒，进一步帮助D N A 通过胞外及胞内的屏障。最近，发展受体介导的内吞、内含体逃逸以及核耙向转基因载体材料引起了广泛的重视，其中典型的方式是将功能分子通过化学键偶联到阳离子型聚合物上，实现 D N A 到靶细胞的选择性输送。作者：T.弗里德曼等,译者：殷勤伟等，本实验来自「基因转移」