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组织和细胞内miRNA丰度的检测实验
实验分类：
免疫学实验
最新修订时间：
简介
miRNA是长度为20-23个核苷酸的单链小分子RNA，在真核生物由RNA聚合酶II催化、以基因组DNA为模板转录产生，但不翻译为蛋白质。miRNA在进化上保守，并广泛存在于动物、植物、真菌及病毒基因组中。
目前，用于组织和细胞内miRNA丰度的检测实验的方法主要有5种：
Northern印迹测定组织和细胞内miRNA丰度、实时定量PCR测定组织和细胞内miRNA丰度、微阵列芯片测定组织和细胞内miRNA丰度、转录组深度测序测定组织和细胞内miRNA丰度、原位杂交测定组织和细胞内miRNA丰度。
原理
根据实验方法不同，对应的原理也有所不同：
Northern印迹测定组织和细胞内miRNA丰度的基本原理是通过凝胶电泳使完全变性的RNA按大小分离，然后利用印迹技术将RNA分子转移到固相支持物上，固定后再采用特异性的探针进行杂交来鉴定其中特定mRNA分子的量与大小。
实时定量PCR测定组织和细胞内miRNA丰度的基本原理依靠荧光标记物和自动化仪器，每次循环都可读出荧光强度，实时监测了反应进程中的PCR产物，从而更精确地实现了对miRNA定量及定性分析。
微阵列芯片测定组织和细胞内miRNA丰度基本原理基于探针杂交检测miRNA，随后对miRNA进行标记，主要采用酶法标记或化学标记，标记物可用生物素或荧光素。
转录组深度测序测定组织和细胞内miRNA丰度基本原理是提取总RNA，给所有的转录产物分别连上3'-RNA和5'-RNA接头，然后进行RT-PCR扩增，并通过纯化得到小RNA文库以用于高通量测序，最后通过与miRNA数据库以及参考基因组比对来分析miRNA的表达清况。
原位杂交测定组织和细胞内miRNA丰度基本原理是以已知序列核酸作为特异性探针与细胞或组织切片中的核酸进行杂交并对其进行检测。
应用
组织和细胞内miRNA丰度的检测实验的常用应用领域如下：癌症早期诊断、肿瘤发生、疾病预测等方面。
来源：丁香实验团队
操作方法
Northem印迹杂交是1977年，StarkGR建立的，与Southern印迹杂交相对应称为Northern印迹(Northern blotting)杂交。
实时定量PCR测定组织和细胞内miRNA丰度由于成熟miRNA的长度仅为约22nt,无法进行PCR扩增反应．所以在进行该法检测之前，要对所提取的miRNA进行结构上的处理。一般的做法是在成熟miRNA的一端连接上一段已知序列的核苷酸，经反转录后，再以此为模板进行后续的PCR扩增。目前常用的是茎环法和加尾法。
微阵列芯片测定组织和细胞内miRNA丰度循环芯片测序又称第二代测序技术、转录组深度测序，即对布满DNA样品的芯片重复进行基于DNA聚合酶或连接酶以及引物对模板进行的一系列延伸反应和荧光序列读取反应，通过显微设备观察并记录连续测序循环中的光学信号。该类测序方法采用了大规模矩阵结构的微阵列分析技术，阵列上的DNA样本可以被同时并行分析。
原位杂交测定组织和细胞内miRNA丰度荧光原位杂交原位杂交是以已知序列核酸作为特异性探针与细菌、细胞或组织切片中的核酸进行杂交并对其进行检测的一种方法。
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