蛋白质实验

细胞内许多蛋白质被磷酸化修饰。蛋白质磷酸化能影响催化活性、蛋白质在细胞中的定位、蛋白质的稳定性、蛋白质二聚化或蛋白质与其他分子形成稳定复合物的能力。有几种技术能鉴定蛋白质是否被磷酸化。为了确切地弄清楚一个特定的蛋白质为什么会被磷酸化，有必要精确地鉴定出是哪个氨基酸残基被磷酸化的。这些氨基酸残基可以被点突变，然后检测突变蛋白质的活性变化、细胞内定位，以及与细胞内其他蛋白质的联系。内容来源于：《精编分

如果样品量不足以用于直接测序，可以用手工Edman降解法来降解肽以确定磷酸化氨基酸在肽中的位置。来源：《精编分子生物学实验指南（第五版）》

CE 分离来自复合体混合物如蛋白酶解产物的特定多肽尤其有用。以下的方案阐述使用低压样品注射的 P/ACE 5000 CE 仪器（Beckman） 的用法。但其他仪器也可以依据制造商的操作指南进行同样的分离。来源：《精编分子生物学实验指南（第五版）》

蛋白质可以在包被或非包被的毛细管柱分离，分离方案的选择取决于靶蛋白的特异属性。最重要的属性就是pl，这由一般的凝胶电泳或CE决定。等电点聚焦分离是CE分离的一种。内容来源于《精编分子生物学实验指南（第五版）》

蛋白质翻译后修饰 (PTM) 在细胞生物调节中发挥着基本作用。PTM 是 mRNA 翻译后蛋白质的酶促共价化学修饰。蛋白质化学修饰非常重要，因为它们会潜在地改变蛋白质的物理或化学性质、组成、活性、细胞定位或稳定性。实际上，在氨基酸或蛋白质的 N 端或 C 端加入或移除化学基团会导致大部分蛋白质发生变化。一些 PTM 可以被动态地添加或移除，这是一种可逆的蛋白质功能调控机制。目前超过 400 个特定

任何方法都不能直接定量蛋白质样品的纯度。通常情况下，蛋白质纯度测定涉及评价特定杂质的含量或仅仅验证蛋白质样品中是否存在杂质。无论最终 g 的是为了解释分析数据、验证过程质量，还是为了确保生物药剂产品的安全性，样品纯度的测定都是至关重要的环节。本章将重点介绍蛋白质样品中蛋白质类杂质的检测方法及其可行性何局限性。

SDS-PAGE 在确定样品中多肽的数量和大小方面已被证明是极有用的分析方法。若能熟练运用的话, 它还具有分离许多大小不一的单体蛋白质的能力。许多人在凝胶电泳应用的早期希望可以利用凝胶的高分辨率特性来获得小量的纯净蛋白质。

膜蛋白在生物进程中具有关键性的作用。它们参与细胞与细胞之间、细胞与细胞基质 之 间 的 相 互 联 系 胞 器 及 细 胞 的 形 成 过 程 ，各种离子、代谢产物和蛋白质的跨质膜运辅 i，R N A 的跨核膜运输等。鉴于膜蛋白在多种细胞功能中的重要性，目前针对各种疾病的药物约有 5 0 % 都以其为靶点。 作者： 伯吉斯等,主译：陈薇，本实验来自「蛋白质纯化指南」

所有形式的亲和层析法都需要两个组分间形成特异性相互作用，通过这种作用可以纯化其中一种组分。免疫亲和层析即利用抗原和抗体的特异性相互作用，是遵循亲和层析原理的一个分类 [综述见 Subramanian(2002)]。事实上，免疫亲和层析是免疫沉淀程序规模放大的拓展应用，不同的部分在于, 层析后需要回收组分 (一般为抗原），即活性蛋白质。

本 章 讲 述 了 基 于 电 泳 的 蛋 白 质 检 测 法 , 重 点 讨 论 总 蛋 白 质 检 测 、常 见 蛋 白 质 翻 译 后 修饰 (P T M ) 检 测 、磷 酸 化 作 用 检 测 和 糖 基 化 作 用 检 测 的 现 有 方 法 。 自 从 本 卷 首 次 出 版 的 20年 以 来 ，S D S - P A G E 以 及 随 后 的 蛋 白 质 染 色 法 ，在 纯

羟基磷灰石 (hydroxyapatite,HA) 是一种以磷酸钙为原料的羟基化物, 其大量地用于蛋白质的层析分离主要是在 1991?2009 年，并且最初只是用于重组蛋白的纯化。HA 的使用方法参照 Tiselius 等（1956) 的论述和 Gorbunoff(1985) 的综述。

在过去的 100 年里，虽然人们已经使用过多种不同的沉淀方法，但是 AS 沉淀一直都得到了最广泛的应用，尤其对于酸性蛋白质。此外，PEI 沉淀的应用也正日益普及。接下来，将会对这两种方法进行详细的讨论, 随后对其他几种沉淀方法做简单概述，并针对沉淀过程中沉淀的处理和纯化效率的最大化提出一般性建议。

蛋白质纯化的层析技术中，凝胶过滤比较独特,它是基于蛋白质分子质量的相对大小而分离。与传统的过滤相反，通过凝胶过滤柱后,并没有任何蛋白质留存于其中。凝胶过滤优缺点明显;优点在于，脆性蛋白质与层析固定相结合并不会破坏其功能;缺点在于,和凝胶不结合则限制层析的分辨率。 作者： 伯吉斯等,主译：陈薇，本实验来自「蛋白质纯化指南」

蛋白质组学和结构基因组学需要这种蛋白质提取方法, 它能够允许同时将几百个蛋白质在不同的载体和宿主的组合上进行筛选 (Stevensetal.，2001)。在这种多因素平行筛选 (multiparallelscreen) 中鉴定出来的能够正确折叠的表达水平高的最佳组合被放大到毫克级规模来生产，以便获得纯品进行功能和结构分析。这种高通量（high-throughout,HT) 的蛋白质表达和纯化策略加

大多数蛋白质都是利用重组表达技术进行制备的。在克隆的过程中，可以将额外的残基或标签添加到目标蛋白质的 N 端或 C 端。这些标签的长度可以从仅仅几个氨基酸残基到全长的蛋白质或结构域，它们可以提高目标蛋白质的产量或者赋予目标蛋白质新的特性，这些特性可以用来对目标蛋白质进行鉴定或者对目标蛋白质进行研究。

当蛋白质在大肠杆菌和其他表达宿主内高水平表达时，通常会发现它们中的大部分是不溶的, 并以称为包涵体的不溶形式存在。尽管包涵体形成的准确机制还不完全清楚，而且可能因蛋白质和表达条件而异，但通常认为是由于目标蛋白质的表达速率快于其折叠出天然结构的速率。 作者： 伯吉斯等,主译：陈薇，本实验来自「蛋白质纯化指南」

报道显 TK，在 过 去 的 1 0 年 ，已经开发出 了多种高效的瞬时转染（transient transfection) 方法 ， 它们可 以 满 足 甚 至 超出 了 上 述 需 求 。 目 前 蛋 白 质 的 瞬 转 表 达 主 要 是 在H E K 2 9 3 衍生的细胞系中进行, 而同时研究人员也在努力发展针对 C H O 细胞的效率相当的方法。这有利于维持相同的宿主细胞背景，从而在治

本章将以介绍基本的杆状病毒-昆虫表达系统的北京信息作为开始，然后重点介绍最近的进展，这些进展极大地方便了普通研究人员对该系统的运用。

重组蛋白是研究生物学过程的重要工具。需要使用表达系统来对其进行制备。合适表达系统的选择取决于重组蛋白的特性、重组蛋白的预期应用以及该系统能否生产足够量的蛋白质。 作者： 伯吉斯等,主译：陈薇，本实验来自「蛋白质纯化指南」

细菌表达系统有各种各样的载体和宿主菌可供选择，大部分工程菌的增殖时间短, 不仅便于快速评价实验结果，而且降低了技术和设备无菌要求的严格性。经过简单的调整, 许多在实验室规模下具有的这些内在优点在大规模的自动生产过程中也具有 。