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        昆虫杆状病毒表达系统的建立

        实验分类:

        DNA 实验

        别名:

        Bac-to-Bac系统

        最新修订时间:

        简介

        杆状病毒是双链DNA病毒,主要感染昆虫,也感染体外昆虫细胞系,对人畜无毒害。苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)是目前宿主最广、应用最多的杆状病毒。

        它与草地贪夜蛾Sf21细胞系建立了广为应用的Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,该系统表达的外源基因,表达量多,能进行产物加工、修饰和折叠,形成有生物活性的产物。

        是当今基因工程领域中的四大表达系统之一,已表达上千种外源基因。

        原理

        Bac-to-Bac系统的技术原理是该系统主要包括供体质粒pFastBac,大肠杆菌DH5a、DH10Bac,昆虫Sf21细胞等。

        供体质粒pFastBac上有Tn7的左右臂序列,两臂之间是病毒多角体基因 polyhedrin的强启动子及其下游的多克隆位点、polyA位点,庆大霉素抗性基因等。

        将外源基因连接到供体质粒上,转化DH5a感受态细胞,提取重组供体质粒,再转化DH10Bac感受态细胞,该细胞含有穿梭质粒Bacmid和辅助质粒 helper,Bacmid上有F复制子,卡那霉素抗性基因及 lacZa肽段编码基因,LacZa基因上有细菌转座子Tn7的附着位点 mini-attTn7。

        重组供体质粒的Tn7在DH10Bac中 helper编码的转座酶帮助下转座到Bacmid上的 mini-attTn7位点,干扰了LacZ的表达,因此具有重组 Bacmid的DH10Bac在庆大霉素、卡那霉素、四环素(辅助质粒对四环素有抗性),及含有X-gal、IPTG的培养板上形成白色菌落。

        提取重组Bacmid,脂质体法转染昆虫Sf21细胞,在培养液中可获得重组病毒,重组病毒可继续感染昆虫细胞,外源基因随着病毒扩增而表达。

        供体质粒pFastBacDUAL有两个克隆位点,一个位于poly-hedrin的启动子下游,一个位于p10启动子下游。

        用它构的重组病毒感染细胞后表达两种蛋白,有的学者把绿色荧光蛋白基因构建到p10启动子下游,表达的绿色荧光作为标记蛋白。

        来源:丁香实验团队

        操作方法

        杆状病毒表达系统的建立

        杆状病毒是双链 DNA 病毒,主要感染昆虫,也感染体外昆虫细胞系,对人畜无毒害。苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)是目前宿主最广、应用最多的杆状病毒,它与草地贪夜蛾 Sf21 细胞系建立了广为应用的 Bac-to-Bac 杆状病毒表达系统。该系统表达的外源基因,表达量多,能进行产物加工、修饰和折叠,形成有生物活性的产物,是当今基因工程领域中的四大表达系统之一,已表达上千种外源基因。

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