昆虫杆状病毒表达系统

首先通过 PCR 扩增、cDNA 文库筛选或人工合成获取目的基因，针对昆虫细胞偏好优化密码子，构建到昆虫表达载体上，如pFastBac系列载体。

pFastBac系列质粒携带Gentamicin抗性基因与Tn7R和Tn7L，Tn7R和Tn7L同源重组臂能够使目的基因转座到Bacmid上。

将质粒转化到DH10Bac感受态细胞中，冰浴30 min，加入无抗 LB，37℃ 200 rpm培养 5 h，涂于三抗LB平板（平板中含有抗生素Kanamycin、Gentamicin、Tetracycline，诱导剂IPTG和显色剂X-gal），37℃避光培养 36-48 h。

DH10Bac细胞中包含亲本Bacmid和辅助质粒。亲本Bacmid包含一个Kanamycin和Tetracycline抗性基因、attTn7位点用于转座目的基因和lacZα用于蓝白斑筛选。辅助质粒提供了供体质粒插入亲本Bacmid靶位点所需要的转座蛋白。

6孔板中接入2 ml无抗培养基与8 x 10⁵个细胞铺板，静止30min使细胞贴壁。准备两个EP管，一个管中加入Cellfectin Ⅱ 6 μl + 100 μl 无抗培养基，另一管加入Bacmid 5 μl + 100 μl 无抗培养基，分别混匀后两管混合，静止20 min，再加入790 μl无抗培养基。

弃去六孔板中的培养基上清，加入孵育混合液，27℃静置孵育 5 h后换液，加入2.5ml含有ps的抗性培养基与0.5 ml FBS，27℃静置培养3-4天。

脂质体转染重组Bacmid进入细胞，Bacmid进入宿主后，启动复制，利用宿主细胞的生物合成系统驱动病毒结构蛋白的合成与组装形成杆状病毒颗粒。成熟的 BV 病毒颗粒通过细胞裂解或出芽方式释放到细胞培养液中，形成初始病毒液P0，此时上清中含有低滴度的重组杆状病毒。

P0—P1：Sf9细胞铺板到15mm²平皿中，加入抗性培养基及1 x 10⁷个细胞，静止30 min以上使细胞贴壁。收获六孔板中上清，500 g离心 5 min，吸取上清，即 P0，将 P0 全部加入铺好细胞的 150 mm dish 中，27℃静置培养 3 天。

P1—P2：收获150mm dish中上清，500g离心5min，取上清加入2% FBS，即P1。小摇瓶中接入30ml Sf9细胞，浓度为1.5-2×10⁶个/ml，根据病毒滴度和MOI加入适量P1，27℃ 100rpm培养60 h。

P2—P3方法同上。P3以上批次的毒不建议用，可能会有突变。

收集初始病毒液P0，感染新鲜的 Sf9 细胞，病毒外壳上的融合蛋白将病毒与细胞膜融合进入细胞质，外壳解离释放出基因组，在细胞内大量复制并释放，得到滴度更高的P1 代或 P2 代病毒。

通过空斑试验检测病毒滴度：

将sf9细胞提前铺板在12孔板中，静止1 h，使细胞贴壁。吸去孔板中的上清培养基，将病毒液稀释6个数量级梯度，10^-1至10^-6，每个梯度两个重复，加入到孔板中室温孵育1 h，吸弃病毒液，每孔加入 2 ml 稀释琼脂糖，静置使凝胶硬化，27°C 恒湿培养箱孵育4–10天，记空斑数。

计算公式：

病毒滴度 (pfu/ml)= 空斑数÷稀释倍数÷每孔接种体积 (ml)

使用病毒体积= MOI×感染细胞个数÷病毒滴度

将稀释的病毒液接种于昆虫细胞单层上，覆盖琼脂糖固体培养基以限制病毒扩散；病毒在感染细胞内复制并裂解细胞，但受固体介质约束，释放的子代病毒仅能感染邻近细胞，经多个增殖周期后形成肉眼可见的“空斑”。

收获细胞，收集上清病毒液，PBS清洗细胞。破碎裂解细胞，4℃13000rpm离心1 h。取上清根据需要进行亲和层析等进一步纯化。

佰莱博生物提供昆虫表达纯化系统、真核表达纯化系统、原核表达纯化系统、及无细胞蛋白表达纯化系统。采用高压破碎仪破碎细胞以保持蛋白活性，采用AKTA蛋白纯化系统纯化蛋白以保证蛋白的纯度。并提供生物分子互作实验及酶活性检测等实验。