DNA 实验

20 世纪 70 年代晚期和 80 年代早期，Dong Hanahan 在冷泉港实验室和哈佛大学做研究生的时候，他做出了以前从未听说过的转化效率，并且在以后他的方法被标准化了。本实验来源「分子克隆实验指南第三版」黄培堂等译。

本实验来源「分子克隆实验指南第三版」黄培堂等译。

大多数常用质粒都含有可被不同内切酶识别的多克隆位点。由于可供选择的克隆位点很多 [ 如 Invitrogen 公司的 PSE280 质粒的克隆位点有 46 个之多，而且还可以设计含有更多克隆位点的多聚接头（Brosius 1992 ) ]，因此一般来说总是能够找到一个带有与某一特定外源 DNA 片段末端相匹配的酶切位点的质粒载体。本实验来源「分子克隆实验指南第三版」黄培堂等译。

Sephacryl S-1000 层析是一个可供选择的将质粒 DNA 与小分子核酸（DNA 和 RNA ) 分离的方法。这一方法由波士顿麻省总医院的 F.DeNoto 和 H.Goodman 首先采用，后来由 Gomez-Marquez 等总结成论文发表于 1987 年。本实验来源「分子克隆实验指南第三版」黄培堂等译。

内容来源：广东药学院实验指导手册。

内容来源：精编分子生物学指南第五版。

在对DNA片段的修饰中，脱磷酸化反应是一个重要内容,该反应有碱性磷酸化酶催化，该酶可使线状DNA上去除5'磷酸基团。

从培养细胞中分离的细胞核制备成的提取物在体外转录和mRNA加工中具有精确的功能，（1）纯化蛋白质（2）核提取物。

DNA的克隆是指在体外将含有目的基因或其它有意义的DNA片段同能够自我复制的载体DNA连接，然后将其转入宿主细胞或受体生物进行表达或进一步研究的分子操作的过程，因此DNA克隆又称分子克隆，基因操作或重组DNA技术。

辅助病毒是一种有时存在于无复制能力病毒原液中的有复制能力的病毒，辅助病毒的存在在动物的感染及谱系分析中会成为问题。

对于某些用途来说（如体内感染细胞），有必要浓缩反转染病毒原液以增加其滴度。如果想要用不编码可选择标记的病毒感染一群细胞，必须用髙滴度的病毒。操作中需用几百毫升至几升的产毒细胞上清。

建立一个能产生高水平的反转录病毒构建体的细胞系是一个长期的过程。首先，必须将反转录病毒构建体稳定地导入一种适当的包装细胞系中。当产生了稳定的细胞系后，必须对之进行鉴定，从中选出能产生具有正确结构的高滴度的病毒的细胞系。

报告基因是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是说，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其它目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控，筛选得到转化体。

报告基因 是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是说，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其它目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控，筛选得到转化体。

分析基因的功能常需要形成含有稳定整合了该基因的哺乳动物细胞系。在转染中大约有1/104细胞将稳定整合外源因而可用一显性（正向）选择标记来分离稳定的转化细胞。用可高效转染的细胞系来确保转染成功。另外，应包括合适的对照以确定目的基因无细胞毒性。

用脂质体将DNA导人各种真核细胞的效率比其他转染方法更高，重复性更好。

电穿孔法应用高压电击短暂或稳定地将DNA导人细胞，是一种目前大受好评的方法。它适用于多数类型的细胞，既可产生高频率的稳定转染，又可产生短暂的基因表达，并且由于其所需步骤甚少，因而比其他技术更为容易。

外源基因进入细胞主要有四种方法：电击法、磷酸钙法和脂质体介导法和病毒介导法。磷酸钙法和脂质体法是利用不同的载体物质携带质粒通过直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因进入细胞。电击法和磷酸钙法的实验条件控制较严、难度较大；病毒法的前期准备较复杂、而且可能对于细胞有较大影响

定点突变是指通过聚合酶链式反应（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因组，也可以是质粒）中引入所需变化（通常是表征有利方向的变化），包括碱基的添加、删除、点突变等。定点突变能迅速、高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。

区域特异性诱变实验，用于（1）基因诱导改造（2）基因的特定表达（3）临床抗肿瘤等靶点的发挥。