反转录病毒产毒细胞系建立实验

实验分类：

DNA 实验

最新修订时间：2022-02-10

简介

建立一个能产生高水平的反转录病毒构建体的细胞系是一个长期的过程。首先，必须将反转录病毒构建体稳定地导入一种适当的包装细胞系中。当产生了稳定的细胞系后，必须对之进行鉴定，从中选出能产生具有正确结构的高滴度的病毒的细胞系。

来源：丁香实验

操作方法

反转录病毒载体导入包装细胞系

1. 在转染前1天，在10 cm 培养皿中接种包装细胞，接种密度大约相当于10%~20%片的细胞数。 2. 将10 μg 含有药物抗性基因的反转录病毒质粒DNA加入0.5 ml HeBS。再加入32 μl 2 mol/l CaCl2并同时轻轻摇晃。用手指轻弹试管外壁约 30 s，然后在室温下温育45 min，直到形成细小的淡蓝色沉淀。 3. 移去包装细胞的培养液，吸取HeBS-DN

测定病毒滴度

1. 感染的前1天按1：10至1：20将靶细胞NIH 3T3分传于6 cm 培养皿中。 2. 进行感染的当天，移去靶细胞的培养液，加入含有病毒原液的培养液。用1~2 ml 含有0.01 μl~0.1 ml 病毒原液的培养液感染6 cm 培养中的细胞，或3~5 ml 感染10 cm 培养皿中的细胞。对于鼠源性的或禽源性的E亚群，加800 μg/ml的polybrene至终浓度8 μg

培养细胞的Xgal染色

1. 弃培荞上清并加固定液，室温下，在通风橱中与2%低聚甲醛共育60 min，或与0.05%戊二醛共育5~15 min。 2. 根据实验室化学物弃置规程弃去固定液，室温下用PBS充分洗涤细胞3次，第1次和第3次是快速洗涤，第2次洗涤时，可保留PBS于细胞上10 min。 3. 加入能覆盖细胞的最小量Xgal溶液，37℃温育1 h 或过夜，阳性细胞被染蓝。