DNA 实验

下面的方案分成 3 个阶段：用 pTet-tTAk 稳定转染成纤维细胞，稳定转染可诱导表达 tTA 的 NIH-3T3 细胞，分析转染细胞中的蛋白表达。稳定转染细胞系表达反式激活因子和靶基因分为两个阶段。本实验来源于分子克隆实验指南（第三版）下册，作者：〔美〕J. 萨姆布鲁克 D.W. 拉塞尔。

哺乳动物细胞抽提物中荧光素酶的测定实验可以用于：（1）测量动物组织中荧光素酶的含量；（2）测量其他如 CAT、β-半乳糖苷酶和碱性磷酸酶的酶活性。

本方案中，我们列出了三种不同的分析方法，可以用来测定报道基因载体 pCAT3 转染哺乳动物细胞后表达的 CAT 酶活性（请见图 17-3）。本实验来源于分子克隆实验指南（第三版）下册，作者：〔美〕J. 萨姆布鲁克 D.W. 拉塞尔。

核连缀分析用于确定某个克隆的基因是否受转录调控。理论上，核连缀分析应该在检测稳定状态 mRNA 水平变化的杂交实验之后，而在启动子分析之前进行。本实验来源于分子克隆实验指南（第三版）下册，作者：〔美〕J. 萨姆布鲁克 D.W. 拉塞尔。

DNA 酶 I 超敏感位点作图法经常用于定位真核基因的调控区。由于还未被理解的原因，基因带有对 DNA 酶 I 切割敏感的分开的序列，而且这些所谓超敏感位点图谱是随基因的激活状态而变化的（Weintrauband Gmudine1976)。本实验来源于分子克隆实验指南（第三版）下册，作者：〔美〕J. 萨姆布鲁克 D.W. 拉塞尔。

凝胶阻滞试验分析 DNA 结合蛋白的方法是 Fried 和 Crothers(1981) 发明的，它是第一次为大肠杆菌乳糖阻抑物与其 DNA 结合位点的相互作用提供了动态的分析方法。本实验来源于分子克隆实验指南（第三版）下册，作者：〔美〕J. 萨姆布鲁克 D.W. 拉塞尔。

本方案介绍在放射性标记的 DNA 片段上确定蛋白质结合位点的作图方法。本方案使用 DNA 酶 I 切割 DNA, 而在替代方案中是用羟自由基断裂 DNA。如果希望得到优化足迹法反应的建议，请参见本方案最后部分的疑难解析以及优化 DNA 酶 I 足迹法反应的栏目。本实验来源于分子克隆实验指南（第三版）下册，作者：〔美〕J. 萨姆布鲁克 D.W. 拉塞尔。

对有希望的基因组或 cDNA 克隆的分析，通常开始于用限制酶消化 λ 噬菌体 DNA 的小量制备物，并对消化产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。所获得的 DNA 可用作限制酶的底物、RNA 合成（由噬菌体 SP6、T3 和 T7 编码的依赖于 DNA 的 RNA 聚合酶来完成）的模板以及 PCR 的模板。本实验来源「分子克隆实验指南第三版」黄培堂等译。

下面讲述的 Polybrene 与 DMSO 转染的方法是 Aubin 等（1997) 方法的改进。利用此方法可以有效地将质粒 DNA 转染中国仓鼠卵巢细胞与角化细胞，产生的转化体比磷酸钙-DNA 沉淀物方法的多 15 倍。但是使用高分子量 DNA 时两种方法的转染效率无明显差别。本实验来源于分子克隆实验指南（第三版）下册，作者：〔美〕J. 萨姆布鲁克 D.W. 拉塞尔。

通过平板培养可对重组噬菌体文库进行扩增，平板培养的原种可直接来源于本方案所述的包装混合物。但只要可能，该扩增过程可被省略，而感兴趣的 DNA 序列可从原始文库直接筛选。扩增将不可避免地降低文库的复杂性，部分原因在于在连续几轮的噬菌体生长中，对生长缓慢的重组噬菌体来说是十分不利的。本实验来源「分子克隆实验指南第三版」黄培堂等译。

下面是拫据 Horch 等（1999)、Sanford 等（1993)、主要基因枪生产商的出版物（US/EG Bulletins 1688 and 2087;Bio-Rad) 以及 Steve Finkbeiner(University of California,San Francisco) 建立的方法总结出来的方案。本实验来源于分子克隆实验指南（第三版）下册，作者：〔美〕J. 萨姆布鲁克 D.

电穿孔可以有效地转染磷酸钙-DNA 沉淀物等其他方法转染效果不好的细胞系。但是，与其他转染方法一样，未使用过的细胞系进行电穿孔转染的实验条件要经过优化。本实验来源于分子克隆实验指南（第三版）下册，作者：〔美〕J. 萨姆布鲁克 D.W. 拉塞尔。

在此介绍经典 DEAE-葡聚糖转染方法的两种形式。第一种（主要方案）细胞短时间接触髙浓度 DEAE-葡聚糖，转染效率较髙，但对细胞的毒性较大。第二种 (备选方案：DEAE-葡聚糖介导的转染：增强细胞存活力）细胞长时间接触较低浓度的 DEAE-葡聚糖，转染效率较低，但细胞存活率较高。本实验来源于分子克隆实验指南（第三版）下册，作者：〔美〕J. 萨姆布鲁克 D.W. 拉塞尔。

下述方法是对 Graham 与 Van der Eb(1973) 建立的磷酸转方法的改进，用高分子量基因组 DNA 代替了质粒 DNA。这一方法对建立稳定的携带补充宿主染色体基因突变的转染基因的细胞系尤其有用（Segeetal.1984,Kingsley et al.1986)。本实验来源于分子克隆实验指南（第三版）下册，作者：〔美〕J. 萨姆布鲁克 D.W. 拉塞尔。

本方法中介绍的磷酸钙介导的质粒 DNA 转染贴壁细胞是对 Jordan 等建立的方法 (1996) 的改进。Jordan 等大大优化了磷酸钙介导的中国仓鼠卵巢细胞与人胚肾 293 细胞的转染方法。本实验来源于分子克隆实验指南（第三版）下册，作者：〔美〕J. 萨姆布鲁克 D.W. 拉塞尔。

下述方法是 Mark Evans 所研究的一种方法的改进（Alexion Pharmaceuticals,New Haven,Connecticut)。本实验来源于分子克隆实验指南（第三版）下册，作者：〔美〕J. 萨姆布鲁克 D.W.拉塞尔。

本实验主要用于获得可溶性的活性蛋白。

多聚组氨酸能与多种过渡金属和过渡金属螯合物结合，因此带暴露的 His-6 的蛋白能结合于固化 Ni2+树脂，用适当缓冲液冲洗去除其他蛋白后，再用可溶的竞争性螯合剂洗脱可以回收靶蛋白。本实验来源于分子克隆实验指南（第三版）下册，作者：〔美〕J. 萨姆布鲁克 D.W. 拉塞尔。

亲和层析方法几乎可以将麦芽糖结合融合蛋白纯化成单组分。麦芽糖结合蛋自（MBP) 是一个由大肠杆菌 malE 基因编码的周质蛋白，是细菌麦芽糖转运系统的成员之一。MBP 能结合微摩尔水平的麦芽糖和麦芽糊精，因此可用交联了麦芽糖的琼脂糖进行纯化。本实验来源于分子克隆实验指南（第三版）下册，作者：〔美〕J. 萨姆布鲁克 D.W. 拉塞尔。

pGEX 载体表达的外源蛋白与谷胱甘肽 S 转移酶融合，因此可以通过谷胱甘肽-琼脂糖亲和层析进行纯化。本实验来源于分子克隆实验指南（第三版）下册，作者：〔美〕J. 萨姆布鲁克 D.W. 拉塞尔。