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- 2025年10月23日
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- 详细信息
- 文献和实验
- 技术资料
- 库存：
100
- 保质期：
5年
- 供应商：
上海烜雅生物科技有限公司
- 保存条件：
-20℃
名称：pENTR223-CARF-T1395G人源基因质粒
别称: NM_024744.16ALS2CR8;NYD-SP24
复制子:pUC
原核抗性:Spe
克隆菌株:DH5a
培养条件:37度
质粒属性
载体宿主：大肠杆菌
载体用途：PCR模板
基因种属：人
基因类型：cDNA
原核抗性：Spe
真核抗性：
荧光蛋白：
质粒简介 : 祥询
质粒序列 ：祥询
质粒菌株产品操作说明书
一、扩增流程
收到产品后，请先根据产品管壁标签来判断产品形式，并在扩增前准确查找该质粒菌株的抗性、感受态和培养温度。
1、质粒干粉（常温运输，存于-20度，90天保质期，请务必转化挑单克隆培养，不要直接使用和测序）
①收到质粒干粉后请先5000rpm离心1min，再加入20μl ddH2O去离子水溶解质粒；
②取1支100μl 感受态于冰上解冻10min，加入2μl质粒，再冰浴30min后，42℃热激60s，不要搅动，再冰浴2min；（从第二步开始均要在超净工作台中无菌操作）
③加入900μl无抗的LB液体培养基，180rpm震荡37℃培养45min；
④6000rpm离心5min，仅留100μl上清液重悬细菌沉淀，并涂布至目标质粒抗性的LB平板上；（可使用本平台的平板涂布专用玻璃珠进行涂布，可以比传统涂布方法获得更多转化子）
⑤将平板正向培养1h，再倒置37℃培养14h。如果要求是30度则培养20h；
（菌落过多则将质粒稀释后再转化。没有菌落则加入10μl质粒转化。另不要直接转表达感受态，要先转克隆感受态，重提质粒后再导入表达感受态）
⑥挑取单菌落至LB液体培养基中，加入对应抗生素，220rpm震荡培养14h，根据实验需要和质粒提取试剂盒说明书提取质粒。
2、甘油菌种（冰袋运输，存于-80℃，保质期90天，请务必划线挑单克隆培养）
四区划线后挑单菌落培养，酵母菌需要先液体复苏再四区划线，再挑单菌落液体培养。
3、穿刺菌种（冰袋运输，存于4℃，保质期7天）
穿刺接种，液体培养后四区划线，再挑单菌落液体培养。
4、菌落平板（冰袋运输，存于4℃，保质期7天）
直接挑取单菌落至液体培养基中。
5、液体质粒（冰袋运输，存于-20℃，保质期90天）
单独提取的液体质粒收到后可直接使用。
6、滤纸质粒（常温运输，存于-20度，90天保质期，请务必转化挑单克隆培养，不要直接使用和测序）
收到货后将滤纸画圈部分剪下放入EP管中，加100ul无菌水将滤纸浸湿并浸泡5min，吸取5ul质粒转化，离心全涂。
二、转化图片
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文献和实验memoday 最近在做一个信号通路的下游磷酸化水平检测，但是做western没有看到任何条带,包括p-ERK,p85。麻烦各位战友帮我分析一下可能原因吧： 1.293T细胞转染质粒（带外源基因），24h 2.无血清培养18h 3.配体（外源基因是该配体的膜受体）激活，37度，10min 4.PLB（promega公司）裂解细胞，做western，抗体是SANTA CRUZ公司的p-ERK (Tyr 204)，以及cell
酶活性；2. 10×CIP 缓冲液和 1U CIP，混合后，37 ℃ 孵育 30～60 min，然后 75 ℃ 加热 15 min 灭活 CIP 活性；3. 琼脂糖凝胶电泳分离并纯化目的 DNA 片段用于连接反应。（二）连接反应【实验试剂与器材】1. T4 DNA 连接酶2. 10×T4 连接酶缓冲液【实验方法与步骤】反应体系：质粒 DNA (0.5(g/? 滋 l) 2? 滋 lDNA 插入片段 (300ng/? 滋 l) 5? 滋 l10× 连接缓冲液 1? 滋 lT4 DNA 连接酶 1? 滋 l加水
这些引物.对所挑选的菌落中的质粒进行 PCR 扩增以鉴定是否有插入片段以及插入片段的大小.例如 T-A 克隆载体,克隆位点两侧有 T 7 、 SP 6 和 M 13 启动子通用序列,用 PCR 鉴定就非常方便.但是多数实验室更喜欢用酶切鉴定。 (二)插入片段方向性鉴定 如果需要 基因表达 ,必需鉴定外源基因在重组质粒中的连接方向.这对于在克隆时使用单酶切位点的情况尤为重要.可以利用联合酶切方案进行目的基因的插入方向鉴 定.在基因插入的邻近末端部位选择一个单酶切点( B
