肉毒碱棕榈酰转移酶（CPT1)生化试剂盒

肉毒碱棕榈酰转移酶（CPT-1）试剂盒

分光光度法 50 管/48 样

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：

肉毒碱棕榈酰转移酶是存在于线粒体内膜的一类酰基转移酶。可逆地催化从酰基辅酶 A 将酰基转移至 L-肉毒碱的反应，在转运脂肪酸通过线粒体内膜的过程中起重要作用。

测定原理：

基于肉碱和脂酰辅酶 A 在丙二酰辅酶 A 存在与否的条件下，通过肉碱脂酰转移酶(CPT-I)的作用，产生脂酰肉碱，并释放出巯基辅酶 A(COA-SH)，与 Ellman 试剂 DN-TB 反应后，产生黄色的 TNB。通过其吸收峰值得变化（412nm），来定量分析 CPT-1 的活性。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵、冰、无水乙醇和蒸馏水

试剂组成和配制：

试剂一：液体 50mL×1 瓶，-20℃保存； 试剂二：液体 10mL×1 瓶，-20℃保存； 试剂三：液体 1mL×1 支，-20℃保存； 试剂四：液体 55mL×1 瓶，4℃保存； 试剂五：粉剂×1 瓶，4℃保存；
试剂六：粉剂×1 支，-20℃保存；

样本的前处理：

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：
①     称取约 0.1g 组织或收集 500 万细胞，加入 1mL 试剂一和 10uL 试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
②     将匀浆液于 600g，4℃离心 5min。
③     弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心 10min。
④     上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的 CPT-1（此步可选做）。
⑤     在步骤④的沉淀中加入 200uL 试剂二和 2uL 试剂三，超声波破碎（冰浴，功率 20％或200W，超声 3 秒，间隔 10 秒，重复 30 次），用于线粒体 CPT-1 测定。

测定步骤：

1、分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 412nm，蒸馏水调零。
2、样本测定

1. 在试剂五中加入 2mL 无水乙醇，混匀，再加入 44mL 试剂四，混匀，37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）孵育 5min；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；
2. 在试剂六中加入 2mL 蒸馏水，混匀，37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）孵育 5min；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；
3. 在 1mL 玻璃比色皿中加入 40μL 样本、880μL 试剂五和 40μL 试剂六，混匀，记录

412nm 处 20 秒时的初始吸光度 A1 和 2 分 20 秒时的吸光度 A2，计算 ΔA=A2-A1。

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