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- 2025年07月16日
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- 详细信息
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- 技术资料
- 库存：
100
- 英文名：
Mitochondrial reactive oxygen species (ROS) test kit
- CAS号：
无
- 保质期：
1年
- 供应商：
上海晅科生物科技有限公司
- 保存条件：
2-8℃
- 规格：
100管/96样
线粒体活性氧产生速率(ROS)检测试剂盒说明书
荧光法 100 管/96 样
正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：
活性氧(Reactive oxygen species, ROS)包括超氧自由基、过氧化氢、及其下游产物过氧化物和羟化物等，研究表明，机体 95％以上的活性氧（ROS）都来自于线粒体，其失衡所致的氧化应激与细胞生长增殖、发育分化、衰老和凋亡以及许多生理和病理过程有关。正常情况下，细胞内抗氧化防御系统与氧自由基处于平衡状态，细胞内活性氧（ROS） 水平维持在较低的生理范围；在病理情况下，细胞内抗氧化系统与氧自由基的平衡被打破， 细胞内活性氧水平过多，就可破坏线粒体酶类、脂类和核酸，使机体出现氧化应激，同时， 活性氧还可攻击线粒体 DNA 产生氧化损伤，导致线粒体 ATP 合成减少、线粒体膜电位破坏等结构和功能变化。
因此，通过检测活性氧的变化来判断线粒体的功能是否正常具有重要意义。
测定原理：
荧光探针-还原型二氯荧光素 (2', 7'-dichlorodihy drofluorescin diacetate, DCFH-DA)可扩散通过线粒体膜，在线粒体内被酯酶水解，形成无荧光的 DCFH，DCFH 迅速与 ROS 反应生成荧光物—氧化型二氯荧光素(2', 7'-dichlo rofluorescin, DCF)。 根据上述原理设计了利用荧光法直接定量检测线粒体 ROS 产生速率的方法。将荧光强度随时间变化的数据点拟合，线性回归直线斜率与 ROS 产生的速率呈正比。需自备的仪器和用品：
多功能酶标仪、恒温培养箱、分析天平、可调式移液器、冰、蒸馏水。试剂组成和配制：
试剂一：液体 120 mL×1 瓶, 4℃保存； 试剂二：液体 50 mL×1 瓶，4℃保存； 试剂三：液体 1.5 mL×1 瓶,-20℃保存；试剂四：粉剂×1 瓶，4℃保存；临用前加入 6 mL 试剂二充分溶解； 试剂五：粉剂×1 瓶，4℃保存；临用前加入 6 mL 试剂二充分溶解； 试剂六：粉剂×1 瓶，4℃保存；临用前加入 6 mL 试剂二充分溶解；
试剂七：粉剂×2 瓶, -20℃保存；临用前每瓶先加入 100μL 试剂八充分溶解，再用试剂二稀释 300 倍后使用；现配现用；
试剂八：液体 1mL×1 支，4℃保存；
线粒体提取：
1、准确称取 0.1g 组织或收集 500 万细胞，加入 1mL 试剂一和 10uL 试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。2、将上述匀浆液于 600g（离心率），4℃离心 5min。
3、弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心 10min。
4、弃上清，沉淀中加入 200μL 试剂二重悬。
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测定步骤：
1、 多功能酶标仪预热 30min 以上，调节激发光 499nm，发射光 521nm。2. 在黑色不透光 96 孔板中加入下列试剂
| 试剂名称（μL） | 测定管 | 空白管 |
| 线粒体悬液 | 20 | |
| 试剂二 | 20 | |
| 试剂四 | 50 | 50 |
| 试剂五 | 50 | 50 |
| 试剂六 | 50 | 50 |
| 试剂七 | 30 | 30 |
| 混匀，37℃避光孵育 15min。 | ||
孵育完成后，在 37℃恒温下测定 10min 内荧光强度，激发波长 499nm，发射波长 521nm， 记录 10min 内的荧光值变化。
ROS 产生速率计算：
对采样数据点即荧光强度随时间的变化进行线性回归拟合处理 ,计算出回归系数,即直线斜率（k）。实际线粒体 ROS 产生速率等于样本荧光强度随时间变化的数据点线性回归直线斜率(k 测定)减去本底荧光强度随时间变的数据点线性回归直线斜率（k 空白）。- 按样本鲜重计算：每 g 组织线粒体每秒钟荧光单位的变化,即 u/ s/g 鲜重
- 按样本蛋白浓度计算：每毫克蛋白线粒体每秒钟荧光单位的变化 u/ s/mg prot。
V 样：加入样本体积，0.02 mL；V 样总：悬液体积，0.2 mL；W: 样本鲜重，g；Cpr: 样本蛋白浓度，mg/mL。
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