Hieff NGS®极速RNA建库试剂盒(Illumina)

Hieff NGS^® Fast RNA Library Prep Kit for Illumina^®是用于Illumina®测序平台的RNA测序文库构建试剂盒，包含宿主（人）rRNA去除试剂，RNA反转录试剂，常规ds-cDNA合成试剂，转座酶和优化的缓冲体系，以及文库扩增试剂。本产品利用专业开发设计的新一代转座酶可以完成5~10 ng ds-cDNA建库，简化了操作流程，将建库时间缩短到3 h。本试剂盒具有优秀的文库转化率，可应用于多种临床样本的建库。经测序验证，不同GC含量的样本，均可获得优异的测序结果，文库覆盖度高，均一性好，偏好性低，使建库变得更加简单高效。提供的所有试剂都经过严格的质量控制和功能验证，最-大程度上保证了文库构建的稳定性和重复性。
 

产品组分

组分编号和名称		12304ES08	12304ES24	12304ES96
12304-A	Random Primer & rRNA Removal Mix	16 μL	48 μL	192 μL
12304-B	1st Reaction Buffer	64 μL	192 μL	768 μL
12304-C	1st Strand Enzyme Mix	16 μL	48 μL	192 μL
12304-D	2nd Reaction Buffer	56 μL	168 μL	672 μL
12304-E	2nd Strand Enzyme Mix	24 μL	72 μL	288 μL
12304-F	5×Reaction Buffer	32 μL	96 μL	384 μL
12304-G	Transposome Mix V1	40 μL	120 μL	480 μL
12304-H	PCR Primer Mix	24 μL	72 μL	288 μL
12304-I	2×Ultima Amplification Mix	200 μL	600 μL	2×1200 μL
12304-J	N5 (N501)*	8 μL	——	——
12304-K	N7 (N701)*	4 μL	——	——
12304-L	N7 (N702)*	4 μL	——	——

 

运输与保存方法

干冰运输。-20℃保存。有效期1年。

 

注意事项

一、关于操作

1. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

2. 请于使用前将试剂盒各组分置于室温解冻。解冻后上下颠倒数次充分混匀，短暂离心后置于冰上待用。

3. 推荐在带热盖的PCR仪中进行各步骤反应，使用前应预热PCR仪至反应温度附近。

4. 请使用无RNase污染的耗材，并对实验区域定期进行清理，推荐使用ThermoFisher公司的RNAZapTM高效核酸去除喷雾去除RNA酶污染。

5. PCR产物因操作不当极容易产生气溶胶污染，进而影响实验结果准确性。推荐将PCR反应体系配制区和PCR产物纯化检测区进行强制性的物理隔离；配备文库构建专用移液器等设备；定时对各实验区域进行清洁（推荐使用ThermoFisher公司的DNAZapTM高效核酸去除喷雾），以保证实验环境的洁净度。

6. 本产品仅作科研用途！

二、关于产品原理

本产品基于转座酶法开发，其核心原理是转座酶及其转座机制。在 Transposome Mix 中包含由转座酶和两种等摩尔的接头Adapter 1和Adapter 2构成一个完整的转座子。转座发生时，该转座子将 Adapter 1 和 Adapter 2 接头序列插入靶基因中，形成一端带有Adapter 1，一端带有 Adapter 2 的 DNA，之后利用DNA聚合酶将转座形成的切口补齐。这种产物经 N5 (N5XX)和N7 (N7XX)以及 P5 和 P7 (PCR Primer Mix)两对引物扩增，产物经分选和纯化后即为可测序文库。

 

图1   Transposome的工作原理

三、关于ds-cDNA的片段化

1. 本试剂盒适用5~10 ng Input ds-cDNA。在 Input ds-cDNA 投入前，使用基于双链 DNA 荧光染料的方法，如 Qubit® ，PicoGreen®等进行定量。【注：Transposome Mix 对 DNA 浓度非常敏感，所以准确的 DNA 浓度测定对实验成功与否至关重要。】

四、DNA磁珠纯化与分选 (Bead-based Clean Up and Size Selection)

1. 建库过程中有多个步骤需要使用DNA纯化磁珠，我们推荐使用Hieff NGS® DNA Selection Beads (Yeasen Cat#12601)或AMPure® XP磁珠(Beckman Cat#A63880)进行DNA纯化和分选。

2. 磁珠使用前应先平衡至室温，否则会导致得率下降、分选效果不佳。

3. 磁珠每次使用前都应充分振荡混匀或使用移液器上下吹打充分混匀。

4. 转移上清时，请勿吸取磁珠，即使微量残留都将影响后续文库质量。

5. 磁珠洗涤使用的80%乙醇应现用现配，否则将影响回收效率。

6. 产物洗脱前应将磁珠置于室温干燥。干燥不充分容易造成无水乙醇残留影响后续反应；过分干燥又会导致磁珠开裂进而降低纯化得率。通常情况下，室温干燥3-5 min足以让磁珠充分干燥。

7. DNA纯化或长度分选产物如需保存，可使用0.1×TE Buffer洗脱，产物于4°C可保存2天，-20°C可保存1个月。

五、关于文库质检 (Library Quality Analysis)

1. 通常情况下，构建好的文库可通过长度分布检测和浓度检测来进行质量评价。

2. 文库浓度检测可使用：基于双链DNA荧光染料的方法，如Qubit®、PicoGreen®等；基于qPCR绝对定量的方法。

3. 推荐使用qPCR方法进行文库浓度检测：Qubit®等基于双链DNA荧光染料的浓度测定方法时，无法有效区分单端连接Adapter的产物、两端均未连接Adapter的产物及其他不完整双链结构产物；qPCR绝对定量基于PCR扩增原理，仅定量样品中两端Adapter完整的文库（即可测序的文库），可排除单端或双端都不连接Adapter的不可测序文库的干扰。

4. 文库浓度检测不可使用：基于光谱检测的方法，如NanoDrop®等。

5. 文库长度分布检测，可通过Agilent Bioanalyzer 2100等基于毛细管电泳或微控流原理的设备进行检测。

六、自备材料 (Other Material)

1. DNA纯化磁珠：Hieff NGS® DNA Selection Beads (Yeasen Cat#12601)或AMPure® XP Beads (A63880)或其他等效产品。

2. N5 (N5XX)和N7 (N7XX) Index引物：Hieff NGS® Tagment Index Kit for Illumina® (96 Index) (Cat#12610ES96)。

3. 文库质检：Agilent 2100 Bioanalyzer DNA 1000 Chip/ High Sensitivity Chip或其他等效产品；文库定量试剂。

4. 其他材料：无水乙醇、无菌超纯水、低吸附枪头、PCR管、磁力架、PCR仪等。

 

建库流程

图2 极速 RNA建库操作流程

 

使用方法

Step 1 宿主rRNA的去除

1. 将 Random Primer & rRNA Removal Mix室温解冻后，颠倒混匀，置于冰上备用。按照下表配置反应液：

表1 宿主rRNA去除反应体系

名称	体积 (μL)
Random Primer & rRNA Removal Mix	2
RNA (10 ng~500 ng)	13
Total	15

2. 使用移液器轻轻吹打混匀，瞬离将反应液离心至管底。

3. 将上述PCR管置于PCR仪中，按照表2所示设置反应程序，进行RNA的预变性。

表2 宿主rRNA去除反应程序

温度	时间
热盖 105°C	On
85°C	5 min
72°C	2 min
60°C	10 min
立即置于冰上	3 min

Step 2 第一链cDNA的合成 (1st Strand Synthesis)

1. 将第一链合成试剂从-20°C取出，室温解冻，颠倒混匀后瞬离。按表6所示，配制第一链cDNA合成的反应液。

表3 第一链cDNA合成反应体系

名称	体积 (μL)
变性的RNA	15
1st Reaction Buffer	8
1st Strand Enzyme Mix	2
Total	25

2. 使用移液器轻轻吹打混匀，瞬离将反应液离心至管底。

3. 将上述PCR管置于PCR仪中，按照表4所示设置反应程序，进行第一链cDNA的合成。反应结束后立即进行第二链cDNA的合成。

表4第一链cDNA合成反应程序

温度	时间
热盖 105°C	On
25°C	5 min
42°C	30 min
85°C	5 min
4°C	Hold

Step 3第二链cDNA的合成 (2nd Strand Synthesis)：

1. 将第二链合成试剂从-20 °C取出，解冻后颠倒混匀；按照表5所示，配制第二链cDNA合成反应液。

表5 第二链cDNA合成反应体系

名称	体积 (μL)
1st Strand cDNA	25
2nd Reaction Buffer	7
2nd Strand Enzyme Mix	3
Total	35

2. 使用移液器轻轻吹打混匀，瞬离将反应液离心至管底。

3. 将上述PCR管置于PCR仪中，按照表6所示设置反应程序，进行第二链cDNA的合成。

表6 第二链cDNA合成反应程序

温度	时间
热盖	Off
16°C	30 min
4°C	Hold

 

Step4 cDNA产物纯化 (Post Ligation Clean Up)

1. 准备工作：将Hieff NGS® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室温平衡至少30 min。配制80%乙醇。

2. 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。

3. 吸取21 μL Hieff NGS® DNA Selection Beads (0.6×，Beads:DNA=0.6:1)至第二链cDNA产物中，涡旋或吹打混匀，室温孵育5 min。

4. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后（约5 min），小心移除上清。

5. 保持PCR管始终置于磁力架中，加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30 sec后，小心移除上清。

6. 重复步骤5，总计漂洗两次。

7. 保持PCR管始终置于磁力架中，开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂（不超过5 min）。

8. 将PCR管从磁力架中取出，加入14 μL ddH2O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀，室温静置5 min。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置，待溶液澄清后（约3 min），小心移取12 μL上清至新PCR管中，取1 μL的纯化测第二链cDNA产物进行Qubit 定量，进行转座酶的片段化。

Step 5 DNA片段化 (DNA Tagment)

1. 准备工作：将 Hieff NGS® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室温平衡至少30 min。配制80%乙醇。将5×Reaction Buffer 室温解冻后，颠倒混匀，置于冰上备用。

2. 于无菌 PCR 管中配制表 7 所示反应体系。

表7 片段化反应体系

名称	体积 (μL)
2nd Strand cDNA纯化产物	5~10 ng
5×Reaction Buffer	4
Transposome Mix V1	5
ddH2O	Up to 20

3. 使用移液器轻轻吹打或低速振荡混匀，并短暂离心将反应液离心至管底。

4. 将上述PCR管置于PCR仪，设置表8所示反应程序，进行DNA片段化，末端修复及dA尾添加反应。

表8 片段化的反应程序

温度	时间
热盖105°C	on
55°C	10 min
4°C	Hold

Step 6 文库扩增 (Library Amplification)

该步骤将对纯化或长度分选后的接头连接产物进行PCR扩增富集。

1. 将表8中的试剂解冻后颠倒混匀，置于冰上备用。

2. 于无菌PCR管中配制表9所示反应体系。

表9  文库扩增PCR反应体系

组分名称	体积 (μL)
片段化产物	20
PCR Primer Mix	3
N5XX*	1
N7XX*	1
2×Ultima Amplification Mix	25
Total	50

【注】：*Hieff NGS® Tagment Index Kit for Illumina® (96 Index)（Cat#12610ES96）中提供8种N5XX和12种N7XX，可根据样品数量和Index选择策略自行选择。

3. 使用移液器轻轻吹打或振荡混匀，并短暂离心将反应液收集至管底。

4. 将PCR管置于PCR仪中，设置表10示反应程序，进行PCR扩增。

表10  文库扩增PCR扩增反应程序

温度	时间	循环数
72°C	3 min	1*
95°C	1 min	1
95°C	10 sec	13~15 cycles**
55°C	30 sec
72°C	30 sec
72°C	1 min	1
4°C	Hold	-

【注】：*此步不可省略。转座反应产物并非完整的双链 DNA，72℃孵育3 min用于生成成熟的PCR模板。

**循环数请根据测序需要进行选择。起始 DNA 量为 5-10 ng 时，推荐 13-15 个扩增循环。

Step 7 扩增产物磁珠纯化 (Post Amplification Clean Up)

1. 准备工作：将Hieff NGS® DNA Selection Beads磁珠由冰箱中取出，室温平衡至少30 min。配制80%乙醇。

2. 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。

3. 吸取45 μL Hieff NGS® DNA Selection Beads (0.9×，Beads:DNA=0.9:1)至PCR产物中，涡旋或吹打混匀，室温孵育5 min。

4. 将PCR管短暂离心并置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后（约5 min），小心移除上清。

5. 保持PCR管始终置于磁力架中，加入200 μL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育30 sec后，小心移除上清。

6. 重复步骤5，总计漂洗两次。

7. 保持PCR管始终置于磁力架中，开盖空气干燥磁珠至刚刚出现龟裂（不超过5 min）。

8. 将PCR管从磁力架中取出，加入21 μL ddH2O，涡旋振荡或使用移液器轻轻吹打至充分混匀，室温静置5 min。将PCR管短暂离心并置于磁力架中静置，待溶液澄清后（约3 min），小心移取20 μL上清至新PCR管中，进行文库定量、质检。

Step 8 文库质量控制

通常情况下，构建好的文库可通过浓度检测和长度分布检测来进行质量评价，具体请参见注意事项五。

附录

使用Hieff NGS® Fast RNA Library Prep Kit for Illumina®对50 ng ~500 ng 293 RNA样本建库，使用0.9×磁珠进行PCR后纯化，结果使用Agilent 2100 Bioanalyzer进行检测。

 

图3 极速 RNA建库峰图

 

HB220117