阪崎肠杆菌荧光及可视化 LAMP 试剂盒

产品及特点:
阪崎肠杆菌（Enterobacter sakazaki）是乳制品中近几年新发现的一种致
病菌。由其引发的婴儿、早产儿脑膜炎、败血症及坏死性结肠炎散发和暴发的
病例已在全球相继出现。多份研究报告表明婴儿配方奶粉是当前发现致婴儿、
早产儿脑膜炎、败血症和坏死性结肠炎的主要感染渠道，在某些情况下，由阪
崎肠杆菌引发疾病而导致的死亡率可达 40%~80%。本公司开发了基于环介导
等温扩增（LAMP）的产品，专门用于检测阪崎肠杆菌。它具有下列特点：
1. 对 20 μL 的反应体系，最大样品加样量达到 14 μL。
2. 含可见光和荧光染料，既可以用金属浴和水浴扩增用可见光肉眼判断结果，
也可用荧光 PCR 仪进行实时荧光检测。
3. 内含的 dUTP-UNG 可防交叉污染。
4. 特异性比 PCR 高，因为 LAMP 扩增使用 4-6 条引物而不是两条。
5. 假阴性率低。
6. 提供无传染性的阳性对照，便于分析实验结果。
7. 只可用于科研，只可进行定性检测，不能用于定量检测。
8. 本产品足够 50 次 20 μL 体系的 LAMP 扩增和检测反应。

规格及成分：

编号	成分	规格
试剂一	5×荧光及可视化 LAMP MagicMix	200 μL（绿盖）
试剂二	Bst DNA 聚合酶 2.0（8U/uL）	50 uL(红盖)
试剂三	20×阪崎肠杆菌LAMP引物混合液	50 μL（白盖）
试剂四	阪崎肠杆菌LAMP阳性对照（1×10E3拷贝/μL）	150 μL（黄盖）
试剂五	超纯水	1 mL（亮黄盖）
	使用手册	1 份

运输及保存：
低温运输，-20℃保存，保存期限为一年。阳性对照最好单独放置，不要污染其他试剂。
自备试剂： 待测样品。
使用方法 准备工作：如果使用水浴锅或金属浴，需要在实验启动前打开并调到 65℃。如果用金属浴，还必须在孔中加水以填充金属孔和反应管间的空隙。本公司发现很多水浴锅或金属浴温度不准，故建议先用阳性对照和阴性对照测试所用仪器在 60℃、62.5℃、65℃、67.5℃和 70℃五个温度下扩增效果，选择阳性和阴性颜色差异最大的温度进行扩增。

• 样品 DNA 的制备 

1. 用自选方法纯化样品的 DNA，本试剂盒跟市场上大多数 DNA 提取试剂盒兼容。
2. 如果有 N 个样品，则至少需要做 N+2 个样品制备，包括一个制备阳性对照（制备时加入自备的跟要检测的靶分子相同的阳性对照模板，一起经历提取过程）和一个制备阴性对照（用水替代样品）。最后 N+2 个样品一起进行 DNA 提取操作，得到 N+2 个 DNA 样品。
二、荧光及可视化 LAMP 扩增及检测（20μL 体系）
3. 第一次使用本试剂盒时，一次性地将 50 μL 的 Bst DNA 聚合酶 2.0 全部 加入到 200 μL 的 5×荧光及可视化 RT-LAMP MagicMix 中，轻柔颠倒 混匀，然后每个 20 μL 反应用 5 μL
4. 反应设置：如果有 N+2 个 DNA 纯化样品，则最好设置 N+4 个 LAMP 扩 增，增加 LAMP阴性对照和 LAMP 阳性对照各1个。在 N+4个 0.2mL PCR 管中加入下列成分：

成分	N+2个样品管	LAMP阴性对照	LAMP阳性对照
5×荧光及可视化LAMP MagicMix	各 4μL	4μL	4μL
20×阪崎肠杆菌LAMP引物混合液	各1μL	1μL	1μL
N+2 个样品 DNA	各 14μL	--	--
超纯水		14μL
试剂盒提供的阳性对照（1×10E3 拷贝/μL）	--	--	14μL
Bst DNA 聚合酶 2.0（8U/uL）	各 1 μL	1 μL	1 μL

5. 混匀后进行扩增。由于本产品含双染料，可以根据实验室条件选择下列三
种方式进行扩增和检测。
6. 如果使用 PCR 仪、金属浴或水浴进行扩增，肉眼检测，则必须先在每个反
应管中加 30 μL 自备的石蜡油，否则保温期间反应体系的水分会蒸发，影
响反应效率（如果使用 PCR 仪器并开启热盖，则可以不加石蜡油）。65℃
保温 90 分钟，肉眼观察管内液体颜色。
7. 如果使用荧光定量 PCR 仪：设为 65℃保温 1 分钟/循环， 60 个循环，
每分钟在 FAM 通道采集一次荧光信号。
8. 如果使用 PCR 仪、金属浴或水浴进行扩增，再使用 qPCR 仪进行终点法
荧光读数：则在扩增前和扩增后，分别在 qPCR 仪器上测荧光读数（温度
设为 65℃，1 次循环，每次循环 1 分钟，在 FAM 通道采集一次荧光信号。注意：测荧光读数必须在 65℃进行）。扩增反应按 65℃ 60 分钟进行。
三、结果分析及解读
9. 如果是用普通 PCR 仪器、水浴或金属浴进行的扩增，反应结束后只能肉眼 判断结果。将反应管放置在白色背景（如白纸）前观察。扩增阳性对照管 内反应液将呈现蓝色，无模板和无引物的阴性对照将呈浅蓝色。如果扩增 阳性对照管内反应液不呈现蓝色，或无模板和无引物的阴性对照任何一个 呈现蓝色，则说明试剂有问题，实验无效。请跟厂家联系。

10. 如果实验有效，则分析 N+2 个样品管的结果。如果样品管反应液的颜色接近扩增阳性对照管则说明有扩增，如果接近无模板和无引物的阴性对照，则说明无扩增。反应结果示例见左图（9 为阴性，10 为阳性）。
11. 如果是用荧光 PCR 仪进行扩增，则可分析扩增曲线和 Ct。试剂盒提供的阳性对照的 Ct 将小于 60，如果大于 60，说明试剂可能失效，需跟厂家联系。无模板阴性对照和无引物阴性对照的 Ct 将大于 90。如果任何小于 90，则说明试剂或环境被污染，需重复实验或跟厂家联系。如果阳性对照和阴性对照 Ct 都在正常范围，则分析样品的 Ct。Ct 小于 60 的判断为阳性，大于 90 判为阴性，在 60-90 之间则需要重复检测。
12. 如果使用 PCR 仪、金属浴或水浴进行扩增，肉眼检测，再使用荧光定量PCR 仪进行终点法荧光读数来判断阴阳性，则先比较阳性对照和阴性对照。阳性对照样品扩增后信号增幅应该超过 100%，阴性对照扩增后信号增幅应该低于 50%，否则实验无效，请与厂家联系。如果两个对照均有效，则比较样品扩增前后荧光读数的差值。如果扩增后荧光信号增幅低于50%，则判断为阴性。如果荧光信号增幅高于 100%，则判断为阳性。荧光信号增幅在 50-100%之间的，则需要重测。
13. 当实时荧光检测和可视化检测同时用于判读结果时，如果彼此不一致，以实时荧光 LAMP 的数据为准。一般可视化结果滞后实时荧光检测结果20-30 分钟，也就是说，在 qPCR 仪上第 30 分钟时呈现阳性的样品，其反应液的颜色变化一般在第 50-60 分钟时才能观察到。