弯曲杆菌LAMP试剂盒

产品及特点:
空肠弯曲杆菌（Campylobacter Jejuni）广泛存在于鸟、禽、狗、猫等动
物体内，可通过污染肉、奶及未经消毒处理的水而导致感染。临床表现为发热、
腹泻、呕吐和肌肉痛，造成空场、回肠和大肠组织损伤。常规的检测方法是荧
光定量 PCR，但该方法操作复杂，灵敏度度不是最高，容易产生假阴性。为解
决此问题，本公司开发了基于环介导等温扩增（LAMP）的产品，专门用于检
测空肠弯曲杆菌。它具有下列特点：
1. 一般 60 分钟内出结果（取决于靶分子浓度），比 PCR 快约 1 小时。
2. 对 20 μL 的反应体系，最大样品加样量达到 14 μL。
3. 含可见光和荧光染料，既可以用金属浴和水浴扩增用可见光肉眼判断结果，
也可用荧光 PCR 仪进行实时荧光检测。
4. 内含的 dUTP-UNG 可防交叉污染。
5. 特异性比 PCR 高，因为 LAMP 扩增使用 4-6 条引物而不是两条。
6. 假阴性率低。
7. 提供无传染性的阳性对照，便于分析实验结果。
8. 只可用于科研，只可进行定性检测，不能用于定量检测。
9. 本产品足够 50 次 20 μL 体系的 LAMP 扩增和检测反应。
规格及成分：

编号	成分	规格
试剂一	4×荧光及可视化 LAMP MagicMix	250 μL（绿盖）
试剂二	20×弯曲杆菌LAMP引物混合液	50 μL（白盖）
试剂三	弯曲杆菌LAMP阳性对照（1×10E3拷贝/μL）	150 μL（黄盖）
试剂四	超纯水	1 mL（亮黄盖）
	使用手册	1 份

运输及保存：
低温运输，-20℃保存，保存期限为一年。阳性对照最好单独放置，不要污染其他试剂。
自备试剂： 待测样品。
使用方法 准备工作：如果使用水浴锅或金属浴，需要在实验启动前打开并调到 65℃。如果用金属浴，还必须在孔中加水以填充金属孔和反应管间的空隙。本公司发现很多水浴锅或金属浴温度不准，故建议先用阳性对照和阴性对照测试所用仪器在 60℃、62.5℃、65℃、67.5℃和 70℃五个温度下扩增效果，选择阳性和阴性颜色差异最大的温度进行扩增。

• 样品 DNA 的制备 

1. 用自选方法纯化样品的 DNA，本试剂盒跟市场上大多数 DNA 提取试剂盒兼容。
2. 如果有 N 个样品，则至少需要做 N+2 个样品制备，包括一个制备阳性对照（制备时加入自备的跟要检测的靶分子相同的阳性对照模板，一起经历提取过程）和一个制备阴性对照（用水替代样品）。最后 N+2 个样品一起进行 DNA 提取操作，得到 N+2 个 DNA 样品。
二、荧光及可视化 LAMP 扩增及检测（20μL 体系）
3. 反应设置：如果有 N+2 个 DNA 纯化样品，则最好设置 N+4 个 LAMP 扩增，增加 LAMP阴性对照和 LAMP 阳性对照各1个。在 N+4个 0.2mL PCR管中加入下列成分：

成分	N+2个样品管	LAMP阴性对照	LAMP阳性对照
4×荧光及可视化LAMP MagicMix	各 5μL	5μL	5μL
20×弯曲杆菌LAMP引物混合液	各1μL	1μL	1μL
N+2 个样品 DNA	各 14μL	--	--
超纯水		14μL	4μL
试剂盒提供的阳性对照（1×10E3 拷贝/μL）	--	--	10μL

4. 置混匀后进行扩增。由于本产品含双染料，可以根据实验室条件选择下列 两种方式进行扩增和检测。
5. 如果使用金属浴或水浴，则必须先在每个反应管中加 30 μL 石蜡油，否则 保温期间反应体系的水分会蒸发，影响反应效率。65℃保温 90 分钟。
6. 如果使用荧光定量 PCR 仪：设聚合温度 65℃，1 次循环 1 分钟，90 个循 环，每分钟在 FAM 通道采集一次荧光信号。
三、结果分析及解读
7. 如果是用水浴或金属浴进行的扩增，反应结束后只能肉眼判断结果。将反 应管放置在白色背景（如白纸）前观察。扩增阳性对照管内反应液将呈现 蓝色，无模板和无引物的阴性对照将呈浅蓝色。如果扩增阳性对照管内反 应液不呈现蓝色，或无模板和无引物的阴性对照任何一个呈现蓝色，则说 明试剂有问题，实验无效。请跟厂家联系。
8. 如果实验有效，则样品管的颜色接近扩增阳性对照管则说明有扩增，如果 接近无模板和无引物的阴性对照，则说明无扩增。反应结果示例如下（9 成分 N+2 个 样品管 LAMP 阴性对照 LAMP 阳性对照 4 × 荧 光 及 可视化 LAMP MagicMix 各 5 μL 5 μL 5 μL 20×空肠弯曲杆菌 LAMP 引物 混合液 各 1 μL 1 μL 1 μL N+2 个样品 DNA 各 14 μL - - 超纯水 14 μL 4 μL 试剂盒提供的阳性对照 （1×10E3 拷贝/μL） - - 10 μL 为阴性，10 为阳性）：

9. 反应结束后，如是用荧光 PCR 仪扩增，则可分析扩增曲线和 Ct。试剂盒 提供的阳性对照的 Ct 将小于 60，如果大于 60，说明试剂可能失效，需跟 厂家联系。无模板阴性对照和无引物阴性对照的 Ct 将大于 60。如果小于 60，则说明试剂或环境被污染，需重复实验或跟厂家联系。如果对照结果 正常，说明实验有效，再分析样品。样品的 Ct 在 60 以下的为阳性，60 以上的为阴性。
10. 当实时荧光检测和可视化检测同时使用时，如果不一致，以实时荧光 LAMP 的数据为准。一般可视化结果滞后实时荧光检测结果 20-30 分钟，也就是 说，在 qPCR 仪上第 30 分钟时呈现阳性的样品，其颜色变化在第 50-60 分钟时才能观察到。