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- 2025年07月16日
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- 英文名：
详见说明书
- 库存：
100
- 供应商：
上海研生
- 规格：
48T 0.2PCR管
PCR实验方法步骤：
方法
1：在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。
10×PCR buffer
5 μl dNTP mix （2mM）
4 μl 引物1（10pM）
2 μl 引物2（10pM）
2 μl Taq酶 （2U/μl）
1 μl DNA模板（50ng-1μg/μl）
1 μl 加ddH2O至 50 μl
视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。
2：调整好反应程序。将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。一般：在93℃预变性3-5min，进入循环扩增阶段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循环30-35次，在72℃ 保温7min。
3：结束反应，PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。 4：PCR的电泳检测：如在反应管中加有石蜡油，需用100μl进行抽提反应混合液，以除去石蜡油；否则，直接取5-10μl电泳检测。
产品特点:
灵敏度高：可检测个位拷贝数的基因
特异性高：有效避免非特异性扩增的出现
稳定性高：复孔间差异小，实验结果重复性强
扩增性能优：扩增效率高，荧光信号强
实时荧光定量PCR：
实时荧光定量PCR技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在电脑软件之中，通过对每个样品Ct值的计算，根据标准曲线获得定量结果。因此，实时荧光定量PCR无需内标是建立在两个基础之上的： 1）Ct值的重现性PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期（对数期），此时微小误差尚未放大，因此Ct值的重现性极好，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的Ct值是恒定的。 2）Ct值与起始模板的线性关系由于Ct值与起始模板的对数存在线性关系，可利用标准曲线对未知样品进行定量测定，因此，实时荧光定量PCR是一种采用外标准曲线定量的方法。 外标准曲线的定量方法相比内标法是一种准确的、值得信赖的科学方法。利用外标准曲线的实时荧光定量PCR是迄今为止定量最准确，重现性定量方法，已得到全世界的公认，广泛用于基因表达研究、转基因研究，药物疗效考核、病原体检测等诸多领域。
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定量PCR方法：
a、竞争法
选择由突变克隆产生的含有一个新内切位点的外源竞争性模板。在同一反应管中，待测样品与竞争模板用同一对引物同时扩增（其中一个引物为荧光标记）。扩增后用内切酶消化PCR产物，竞争性模板的产物被酶解为两个片段，而待测模板不被酶切，可通过电泳或高效液相将两种产物分开，分别测定荧光强度，根据已知模板推测未知模板的起始拷贝数。 b、内参照法
在不同的PCR反应管中加入已定量的内标和引物，内标用基因工程方法合成。上游引物用荧光标记，下游引物不标记。在模板扩增的同时，内标也被扩增。在PCR产物中，由于内标与靶模板的长度不同，二者的扩增产物可用电泳或高效液相分离开来，分别测定其荧光强度，以内标为对照定量待检测模板。
c、PCR－ELISA法
利用di高辛或生物素等标记引物，扩增产物被固相板上特异的探针所结合，再加入抗di高辛或生物素酶标抗体－辣根过氧化物酶结合物，最终酶使底物显色。常规的PCR－ELISA法只是定性实验，若加入内标，作出标准曲线，也可实现定量检测目的。
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文献和实验增菌，费时费力。FDA于1987年最新研制出针对李斯特菌致病基因β 溶血素的探针，随后GENE-TARK研制出商品化检测李斯特菌的DNA探针，它能特异性识别细菌的16SrRNA.该探针是由人工合成的寡核苷酸，用比色法检测样品需先在LEB中培养16 22h,然后侵染比色检测，假阴性率为0.8 4.7%（常规法为1.4 2.9%.）1989年Bessesea等运用扩增李斯特菌溶血素基因中386bp的PCR方法检测单核细胞增生型李斯特菌，DNA检测量低于25ng,即少于1000个菌体，特异性强，能检测
属、枸橼酸杆菌属、克雷伯菌属和沙雷氏菌属等。而不发酵乳糖的细菌如沙门菌、变形杆菌和肠杆菌科中其他不发酵乳糖的细菌ONPG试验均为阴性。④其他生化试验：如淀粉水解试验、七叶苷水解试验、甲基红试验及VP试验等。（3）革兰氏染色法：染色除能观察细菌形态外，还可根据其染色反应，将细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性菌两大类。如沙门菌属、志贺菌属、巴斯德杆菌及耶尔森菌等均为革兰氏阴性菌，革兰氏阳性菌有肺炎链球菌、单核细胞增生性李斯特杆菌、金黄色葡萄球菌、鼠棒状杆菌等。（4）血清学鉴定：除生化鉴定外，必要时可进
法和 Chelex 树脂法阳性检出率仅为吸附柱核酸纯化法的 52. 78% 和 55. 56%。在阳性标本中，同一标本的定量值也较吸附柱核酸纯化法低 1-2 lg 拷贝 /mL。 ②该系统用于检测的每份血清标本量较大。CAP-CTM 试剂盒用于检测的每份血清量达 650 uL，而国产 HBV DNA 检测试剂盒用于检测的血清标本量一般仅为 50-100 uL，但两者提取到的待测 HBV DNA 产物容积一般均为 50 uL。而且，由于反应管体积的限制，进行 PCR 检测时只能再取其中的 2-5 uL
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