动物脑缺血再灌注模型构建

一、模型分类与选择依据

根据缺血范围和实验需求，主要分为以下三类：

1. 局灶性缺血模型
   • 应用场景：模拟大脑中动脉栓塞（如临床卒中），研究局部神经元损伤及侧支循环代偿。
   • 代表模型：

• 线栓法（MCAO模型） ：通过插入硅胶线栓阻断大脑中动脉血流，再灌注时撤出线栓。
• 光化学法：光敏剂结合激光照射诱导局部血栓形成，适合微循环研究。

1. 全脑缺血模型
   • 应用场景：研究心脏骤停后全脑缺氧损伤及复苏后神经保护。
   • 代表模型：

• 双侧颈总动脉结扎（2VO） ：联合低血压或颈部加压实现全脑血流中断。
• 四血管阻断法：阻断双侧颈总动脉和椎动脉，模拟更严重的全脑缺血。

1. 基因工程模型
   • 应用场景：验证特定基因（如NMDA受体、SOD）在缺血损伤中的作用。
   • 代表模型：

• CRISPR编辑小鼠：敲除TRPM4或过表达抗氧化酶，用于研究离子通道与氧化应激。

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二、核心构建技术

1. 线栓法（MCAO模型）

• 操作流程：

  1. 雄性C57Bl/6小鼠（22-28g）异氟醚麻醉（5%诱导，2.5%维持）。
  2. 颈部正中切口，分离右侧颈总动脉（CCA）、颈外动脉（ECA）和颈内动脉（ICA）。
  3. 结扎ECA头端，ICA近心端挂线备用，CCA暂时阻断。
  4. 将直径0.22mm硅胶线栓经ECA插入至ICA颅内段（深度9-11mm），阻断大脑中动脉血流。
  5. 60分钟后撤栓恢复血流，观察再灌注损伤。

• 技术优化：

  • 线栓直径：小鼠推荐0.22-0.25mm，过大易致血管破裂。
  • 进线深度：9mm达大脑前动脉分叉处，11mm阻断MCA全程。

2. 全脑缺血模型（2VO）

• 操作流程：

  1. SD大鼠麻醉后分离双侧颈总动脉。
  2. 临时结扎动脉，配合颈部棉线加压（压力100-120mmHg）阻断侧支循环。
  3. 缺血30分钟后松解结扎，恢复血流60分钟。

• 关键指标：

  • 脑电图平坦化：缺血后数秒内脑电波消失，确认全脑缺血成功。
  • 乳酸脱氢酶（LDH）活性：再灌注后LDH下降50%，提示能量代谢崩溃。

3. 光化学法

• 操作要点：
  • 光敏剂注射：玫瑰红（20mg/kg）经尾静脉注入。
  • 激光照射：532nm绿光照射目标血管区，诱导内皮损伤和血栓形成。

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三、模型验证与评估体系

1. 神经行为学评估

• Garcia评分：

  指标	评分标准（0-3分）
  自发性活动	0=无，3=频繁探索
  四肢对称性	0=完全瘫痪，3=对称运动
  前爪伸展	0=无法伸展，3=双侧协调
  总分范围	0-18分（<10分提示重度损伤）

• 转棒实验：评估运动协调性，缺血组跌落时间缩短60%。

2. 病理与分子检测

• TTC染色：

  • 原理：活细胞线粒体酶还原TTC为红色甲臜，梗死区呈苍白色。
  • 定量：梗死体积占比=苍白区面积/全脑切片面积×100%。

• 氧化应激指标：

  • MDA水平：再灌注后升高2-3倍，反映脂质过氧化程度。
  • SOD活性：下降40-60%，提示抗氧化能力受损。

• 电镜观察：

  • 线粒体肿胀：嵴结构断裂，基质空泡化。
  • 突触结构破坏：突触小泡数量减少50%。

3. 影像学评估

• MRI-DWI：缺血30分钟ADC值下降30%，再灌注后部分恢复。
• 激光散斑成像：实时监测脑血流变化，再灌注初期血流超常增加20%。