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上海达为科生物科技有限公司
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细胞DAPI染色实验
一、实验材料与试剂配置
1. 核心试剂
- DAPI原液:1 mg/mL(溶于无菌去离子水或DMF),避光保存于-20℃,有效期2年。
- 固定剂:4%多ju甲醛(常规细胞)或甲醇(需快速穿透样本),4℃保存。
- 通透剂:0.1-0.5% Triton X-100(贴壁细胞)或0.1% Tween-20(悬浮细胞)。
- 抗淬灭剂:含DAPI的Vectashield®或ProLong® Gold。
2. 工作液配制
| 溶液类型 | 浓度 | 配制方法 | 应用场景 |
|---|---|---|---|
| 储备液 | 1 mg/mL | 1 mg DAPI溶于1 mL去离子水或DMF,超声助溶 | 长期储存 |
| 中间稀释液 | 300 μM | 取2.1 μL储备液加入100 μL PBS | 预实验浓度梯度测试 |
| 染色工作液 | 0.1-1 μg/mL | 取1-10 μL中间液加入1 mL PBS | 常规染色(活/死细胞) |
| 固定染色混合液 | 0.5 μg/mL | 直接加入4%多ju甲醛中 | 同步固定与染色 |
二、标准化操作流程
1. 贴壁细胞染色(以24孔板为例)
- 固定:吸弃培养基,加入4%多ju甲醛(1 mL/孔),室温15分钟。
- 通透:PBS洗涤3次,加入0.1% Triton X-100(1 mL/孔),室温10分钟。
- 染色:加入300 nM DAPI工作液(200 μL/孔),避光孵育5分钟。
- 洗涤:PBS冲洗3次(每次2分钟),去除游离染料。
- 封片:滴加抗淬灭剂(10 μL/孔),盖玻片轻压排气泡,4℃避光保存。
2. 悬浮细胞染色
- 离心富集:200×g离心5分钟,弃上清,PBS重悬至1×10⁶ cells/mL。
- 固定染色:加入4%多ju甲醛(终浓度2%)和DAPI(终浓度0.5 μg/mL),冰上避光30分钟。
- 洗涤:PBS洗涤2次,重悬于100 μL PBS,流式细胞仪检测或涂片观察。
3. 组织切片染色
- 脱蜡水化:二甲苯梯度脱蜡,乙醇梯度复水至PBS。
- 抗原修复:柠檬酸钠缓冲液(pH 6.0)95℃处理20分钟(可选)。
- 染色封片:滴加DAPI工作液(50 μL/片),避光10分钟,甘油封片。

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