免疫组化

一、免疫组化技术原理与核心步骤

1. 技术原理

• 抗原-抗体反应：利用一抗特异性识别靶蛋白（如TLR4、NF-κBp65），二抗（酶标或荧光标记）放大信号，通过显色剂（如DAB）或荧光成像实现可视化。
• 定位与定量：可区分蛋白在细胞核、质或膜中的分布，结合图像分析软件（如IPP 6.0）进行半定量评分。

2. 标准化操作流程

根据文献整合，典型流程包括以下步骤：

1. 样本制备：
   • 结肠组织经10%中性甲醛固定24-48小时，梯度乙醇脱水，石蜡包埋后切片（厚度4-5 μm）。
   • 需使用防脱载玻片（如多聚赖氨酸包被）防止组织脱落。
2. 抗原修复：
   • 微波法：枸橼酸盐缓冲液（pH 6.0）加热至沸腾，维持10-15分钟。
   • 高压修复：适用于顽固抗原（如膜蛋白），121℃高压处理20分钟。
3. 封闭与一抗孵育：
   • 5% BSA或血清封闭非特异性结合位点15-30分钟。
   • 一抗稀释度根据靶标优化（如TLR4 1:200，NF-κBp65 1:2000），4℃湿盒过夜。
4. 信号放大与显色：
   • 酶标二抗（HRP标记）37℃孵育20分钟，DAB显色控制至棕黄色颗粒出现。
   • 苏木素复染细胞核，梯度乙醇脱水，中性树胶封片。